Searching for new targets and carriers for antisense oligonucleotides with antibacterial properties

Abstract

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) umieściła zakażenia powodowane przez antybiotykooporne bakterie Escherichia coli na pierwszym miejscu listy chorób zakaźnych, których zwalczaniu oraz zapobieganiu należy nadać najwyższy priorytet. Pojawienie i rozprzestrzenienie się bakteryjnych szczepów antybiotykoopornych jest istotnym problemem, którego rozwiązanie wymaga zastosowania nowatorskich strategii przeciwbakteryjnych. Syntetyczne antysensowne oligonukleotydy, stosowane do zahamowania procesu syntezy białek niezbędnych do życia bakterii, mogą okazać się pomocne w zwalczaniu zakażeń bakteryjnych. Peptydowe kwasy nukleinowe (PNA) są syntetycznymi analogami kwasów nukleinowych, które zawierają neutralny szkielet, są odporne na działanie enzymów degradujących kwasy nukleinowe i białka oraz tworzą stabilne kompleksy zarówno z DNA, jak i RNA. Celem mojej rozprawy doktorskiej było (a) zbadanie potencjału naturalnych bakteryjnych systemów toksyna-antytoksyna (TA) jako nowych celów dla związków indukujących efekt przeciwbakteryjny oraz (b) opracowanie skutecznej i nieinwazyjnej metody wprowadzania krótkich, modyfikowanych oligonukleotydów do komórek bakterii. W pracy opisano trzy strategie związane z wykorzystaniem systemów TA (i powiązanych z nimi białek) jako celów dla cząsteczek antybakteryjnych. Pierwsza z nich zakładała bezpośrednią aktywację toksyn MazF i HipA E. coli poprzez wykorzystanie antysensownych oligomerów PNA hamujących translację odpowiednich antytoksyn (odpowiednio MazE i HipB). Druga strategia prowadziła do pośredniej aktywacji działania toksyny MazF, co osiągnięto poprzez „wyciszenie” genu thyA, kodującego syntazę tymidylanową (stres wywołany niedoborem tyminy powoduje aktywację systemu mazEF i w konsekwencji zahamowanie wzrostu komórki). Trzecia strategia polegała na „naśladowaniu” działania toksyny HipA (inaktywującej syntazę glutamylo-tRNA) poprzez wyciszenie genu gltX, kodującego ww. syntazę. Na podstawie przewidzianych struktur drugorzędowych i trzeciorzędowych docelowych mRNA zaprojektowano cztery antysensowne sekwencje PNA: anty-mazE, anty-hipB, anty-thyA oraz anty-gltX. Badania przeprowadzono na trzech szczepach E. coli: laborotoryjnym K-12, pochodnym szczepu enterokrwotocznego O157:H7 oraz szpitalnym szczepie WR3551/98. Wszystkie zaprojektowane sekwencje PNA prowadziły do zahamowania wzrostu komórek badanych szczepów E. coli. Wartość MIC (ang. Minimal Inhibitory Concentration) dla poszczególnych PNA różnił się w zależności od badanego szczepu E. coli i były w przedziale 1-16 µM. Przy pomocy RT-qPCR zbadano wpływ PNA na poziom ekspresji poszczególnych genów. Stwierdzono znaczne obniżenie poziomu docelowych mRNA po inkubacji z komplementarnymi PNA, potwierdzając specyficzność oddziaływania tych związków z odpowiednimi transkryptami. Zbadano także oddziaływania synergistyczne między PNA a wybranymi chemioterapeutykami (trimetoprym oraz sulfametoksazol). Synergię działania zaobserwowano w połączeniu PNA anty-thyA z trimetoprymem. W końcowym etapie zbadano wpływ sekwencji PNA na powstawanie populacji komórek przetrwałych (ang. persister cells). Modyfikowane oligonukleotydy wykazują wiele interesujących właściwości biologicznych i mogłyby być potencjalnymi lekami, niestety ograniczony transport przez błony biologiczne sprawia, że nie znalazły one szerszego zastosowania. W pracy wykorzystano witaminę B12 jako nośnik antysensownych oligonukleotydów – PNA i 2’OMe RNA – do komórek E. coli. Przetestowano łącznie 17 koniugatów witamina B12-PNA, udzielając odpowiedzi na trzy zasadnicze pytania: (1) które elementy strukturalne witaminy B12 są kluczowe dla rozpoznawania koniugatów z oligonukleotydem, (2) która pozycja w strukturze jest najlepsza do syntezy koniugatów oraz (3) czy rodzaj oraz długość łącznika ma znaczenie w dostarczaniu koniugatów do komórek E. coli. Wykazano, że modyfikacje witaminy B12 w obrębie pierścienia koryny wpływają niekorzystanie na transport PNA, w porównaniu do modyfikacji w miejscu R5’. Ponadto zaobserwowano, że struktura i długość łącznika miały istotny wpływ na dostarczanie PNA. Docelowo, wykazano także antybakteryjny potencjał koniugatów B12-PNA. Podsumowując, wyniki badań przedstawione w mojej rozprawie doktorskiej dowodzą, że systemy TA są wrażliwe na działanie antysensownych PNA, a zaburzenie ich funkcjonowania in vivo prowadzi do zahamowania wzrostu bakterii. Wyniki te stanowią dowód poprawności koncepcji i zachęcają do kontynuacji prac nad wykorzystaniem natywnych systemów TA w opracowywaniu nowych strategii antybakteryjnych. Ważny jest również wybór optymalnych nośników wprowadzających antysensowne oligonukleotydy do komórek bakteryjnych, takich jak badana przeze mnie witamina B12.The World Health Organization has placed antibiotic-resistant Escherichia coli at the top of the list of most important pathogens at a global level for which there is an urgent need for new treatments. The emergence of antibiotic-resistant bacterial strains is a critical issue which requires innovative antibacterial strategies to solve. One approach is the use of short, synthetic, antisense oligonucleotides (ASO) as inhibitors of bacterial growth. Such specifically designed oligonucleotides suppress proper expression of bacterial genes by complementary binding to bacterial RNA. One of the most extensively used ASOs are Peptide Nucleic Acids (PNA) which can be used to modulate the expression of target genes. PNA are synthetic DNA analogues with high affinity to natural nucleic acids. Due to their resistance to nucleases and proteases, PNAs exhibit high stability in the intracellular environment. The aim of this dissertation was (a) to explore the potential of natural bacterial toxin-antitoxin (TA) systems as new targets for compounds inducing antibacterial effects, and (b) to develop an effective and non-invasive method of introducing short, modified oligonucleotides into bacterial cells. This dissertation describes three innovative strategies that utilize antibacterial ASOs to target the TA systems and related proteins. The first method was the artificial activation of the E. coli MazF and HipA toxins by using antisense PNA oligomers to inhibit the translation of the corresponding antitoxins (MazE and HipB, respectively). The second strategy involved the indirect activation of the MazF toxin by inducing thymine starvation. This was achieved by silencing the thyA gene which encodes for thymidylate synthase, an enzyme involved in folic acid metabolism, that has been shown to interfere with mazEF-mediated growth inhibition. The third strategy was to mimic the action of the HipA toxin by silencing the gltX gene encoding its cellular target glutamyl-tRNA synthase. Based on the predicted secondary and tertiary structures of the targeted mRNAs, four antisense PNA sequences were designed: anti-mazE, anti-hipB, anti-thyA and anti-gltX. To evaluate the potential of antisense PNAs to inhibit the growth of E. coli strains, the minimal inhibitory concentrations (MIC) of the compounds were determined. Experiments were performed with three E. coli strains: K-12 – wild type; O157:H7 – the derivative of an enterohaemorrhagic strain and a clinical, multi-drug resistant strain WR3551/98. All tested PNAs inhibited the growth of the tested E. coli strains, however the MIC values depended on the PNA sequence as well as on the tested strain. The effectiveness of antisense silencing was estimated by quantifying mRNA abundance by RT-qPCR. Upon treatment with sequence-specific PNAs, a significant decrease in the level of corresponding gene transcript levels was observed. Next, this study investigated the synergistic interactions between PNAs and selected chemotherapeutics (trimethoprim and sulfamethoxazole). The synergy was found through a combination of PNA anti-thyA with trimethoprim. In the final stage of the project, the effect of the PNA sequences on the formation of persister cells was also studied. Modified oligonucleotides present many interesting biological properties and are exciting candidates as antibacterial drugs. However, the uptake of such oligonucleotides is hindered by the bacterial cell wall, which precludes their use as antibiotics. To solve this problem, vitamin B12 was used as a carrier of ASOs: PNA and 2'OMe RNA, into E. coli cells. A total of 17 conjugates of vitamin B12-PNA were tested. Three basic questions were answered: (1) which structural elements of vitamin B12 are essential for the recognition of oligonucleotide conjugates by E. coli receptors, (2) which position in the vitamin B12 structure is optimal for the synthesis of conjugates, and (3) whether the type and length of the spacer and linker are relevant for the delivery of conjugates to E. coli cells. It was shown that vitamin B12 modifications within the corrin ring affect the PNA transport as compared to the non-corrin ring modification (R5’-OH). Moreover, it was observed that the structure and length of the linker had a significant influence on the delivery of PNA. Finally, the antibacterial potential of B12-PNA conjugates was also demonstrated. In conclusion, the results of the research presented in this doctoral dissertation demonstrate that TAs are susceptible to sequence-specific antisense agents and provide a proof-of-concept for their further exploitation in antimicrobial strategies. This research also illustrates, through the example of vitamin B12, the importance of choosing the optimal carrier for introducing antisense oligonucleotides into bacterial cells