Search of thermostable lipolytic enzymes in a hot spring metagenomic library

Abstract

[Resumen] Las enzimas con actividad lipolítica termoestables presentan un gran potencial de uso en la industria biotecnológica siendo empleadas en la síntesis de biopolímeros, biodiesel, producción de fármacos y cosméticos entre otros productos. La búsqueda de actividad lipolítica en metagenotecas de aguas termales es de especial interés por la capacidad de estas enzimas de actuar en condiciones de altas temperaturas y otros factores extremos que pueden facilitar su uso en el ámbito industrial. En el presente trabajo, se transfirió el ADN de una metagenoteca elaborada en Escherichia coli a partir del manantial geotermal de Río Caldo (Ourense) a la cepa de Thermus thermophilus BL03, cepa que tiene deleccionadas las secuencias que codifican para enzimas con actividad lipolítica. Previamente, se determinó el agua que se debería usar para llevar a cabo los pasos de transformación y cultivo de T. thermophilus. Se extrajo el ADN de E. coli, se determinó su concentración y grado de pureza. Posteriormente, se realizó o la transformación de T. thermophilus BL03 y se obtuvieron algunas colonias que produjeron halos alrededor de las mismas en placas con tributirina. Los candidatos que produjeron halo se sembraron en placas de medio mínimo con este mismo sustrato, en el que la cepa silvestre T. thermophilus HB27 es capaz de crecer, y la cepa mutada T. thermophilus BL03 sin transformar no. Las que crecieron en este medio se confirmaron como positivas. Finalmente, se procedió a caracterizar la temperatura óptima de las enzimas con actividad lipolítica. Se determinó que la temperatura óptima del primer candidato es de 80oC y la del segundo de 90oC o mayor.[Resumo] As enzimas con actividade lipolítica termoestables presentan un gran potencial de uso na industria biotecnolóxica sendo empregadas na síntese de biopolímeros, biodiesel, produción de fármacos e cosméticos entre outros produtos. A procura de actividade lipolítica en metaxenotecas de augas termais é de especial interese pola capacidade destas enzimas de actuar en condicións de altas temperaturas e outros factores extremos que poden facilitar o seu uso no ámbito industrial. No presente traballo, transferiuse o ADN dunha metaxenoteca elaborada en Escherichia coli a partir do manantial xeotermal de Río Caldo (Ourense) á cepa de Thermus thermophilus BL03, cepa que ten deleccionadas as secuencias que codifican para enzimas con actividade lipolítica. Previamente, determinouse a auga que se debería usar para levar a cabo os pasos de transformación e cultivo de T. thermophilus. Extraeuse o ADN de E. coli, determinouse a súa concentraci ón e grado de pureza. Posteriormente, realizouse a transformación de T. thermophilus BL03 e obtivéronse algunhas colonias que produciron halos ao redor das mesmas en placas con tributirina. Os candidatos que produciron halo pasáronse a placas de medio mínimo con este mesmo sustrato, no que a cepa silvestre T. thermophilus HB27 é capaz de crecer, e a cepa mutada T. thermophilus BL03 sen transformar non. As que creceron neste medio confirmáronse como positivas. Finalmente, procedeuse a caracterizar a temperatura óptima das enzimas con actividade lipolítica. Determinouse que a temperatura óptima do primeiro candidato é de 80oC e a do segundo de 90oC ou maior.[Abstract] Lipolytic thermostable enzymes have great potential of use in the biotechnology industry being employed in the synthesis of biopolymers, biodiesel, production of pharmaceuticals and cosmetics, among other products. Search of thermostable lipolytic activity in hot springs metagenomics libraries has special interest for the capacity of these enzymes to operate at high temperature conditions and other extreme factors that can facilitate their industrial use. In this work, the DNA of a metagenomic library from the Rio Caldo (Ourense) hot spring built in Escherichia coli was transferred to Thermus thermophilus BL03 strain, this strain has truncated the sequences encoding enzymes with lipolytic activity. Previously, It was determined the water that should be used to perform the steps of transformation and culture of T. thermophilus. Next, DNA from E. coli was extracted and its concentration and purity was determined. Subsequently, transformation of T. thermophilus BL03 was performed and some colonies with halos around them on tributyrin plates were obtained. Halo candidates were plated on minimal medium with the same substrate, wherein the wild strain T. thermophilus HB27 is able to grow, and the mutated T. thermophilus BL03 strain untransformed cannot grow. Candidates that grew in this medium were confirmed as positive. Finally, a characterization of the optimal temperature of the enzymes with lipolytic activity was performed. Optimal temperature of one candidate was 80oC and the second candidate showed an optimal temperature of 90oC or greater.Traballo fin de grao (UDC.CIE). Bioloxía. Curso 2015/201