Crystallization of porcine insulin with carbon dioxide as acidifying agent

Abstract

A cristalização é uma técnica de separação e purificação largamente utilizada na produção de produtos químicos, farmacêuticos e alimentícios. A maioria dos produtos sólidos é obtida por processos de cristalização/precipitação que provavelmente é a segunda mais importante tecnologia de separação em termos de capacidade, perdendo apenas para processos de destilação. Estudos sobre o uso de eletrólitos voláteis como o CO2, empregados na precipitação de proteínas, mostram que esses agentes são alternativas promissoras ao uso de ácidos convencionais, pois sua dissolução em solução aquosa gera íons com concentrações fortemente dependentes da temperatura ou pressão, o que facilita sua remoção do sistema. No entanto, não se tem relatos do uso de eletrólitos voláteis na cristalização de proteínas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo estudar a viabilidade de cristalizar uma proteína (insulina suína) utilizando eletrólito volátil (CO2) como agente de cristalização (agente acidificante). Ensaios de cristalização exploratórios foram realizados para adequar as condições de cristalização e metodologias àquelas usadas na cristalização convencional de insulina. Cristais de formato romboédrico, comum para os cristais de insulina suína que contém zinco em sua estrutura, foram obtidos já nos primeiros ensaios após se ajustar as condições de pH, concentração inicial de insulina e concentração de zinco. Em seguida, a curva de solubilidade de insulina suína no sistema NaHCO3/ZnCl2/CO2 a 15°C foi determinada como função do pH para a faixa de 6,0 a 8,0. Nos ensaios de dissolução e cristalização pode-se observar, através de análises de DSC, que a insulina apresenta duas diferentes estruturas. A partir desses ensaios, foi possível estimar a cinética de dissolução, a cinética de crescimento e a taxa de nucleação dos cristais de insulina como função da supersaturação.Crystallization is a separation and purification technique used in the production of chemical, pharmaceutical and food products. The majority of the solid products is obtained by crystallization/precipitation processes that probably are the second most important separation technology in terms of capacity, behind only distillation processes. Studies on the use of volatile electrolytes such as CO2 in protein precipitation showed that these agents are a promising alternative to conventional acids. Volatile electrolytes dissolve and dissociate in water resulting in ions whose concentrations are dependent on the temperature and pressure of the system, what facilitates their removal from system. However, there is no report of the use of volatile electrolyte in protein crystallization. Therefore, the objective of this work was to study the feasibility of protein crystallization (porcine insulin) using volatile electrolyte (CO2) as crystallization agent (acidifying agent). The crystallization conditions and methodologies were adjusted in preliminary experiments. Rhombohedral crystals − the common shape for porcine insulin crystals that contain zinc in their structure − were obtained in the first crystallization runs after adjustment of pH, initial concentrations of insulin and zinc. The solubility curve for insulin in the NaHCO3/CO2/ZnCl2 system at 15°C was determined as a function of pH in the range of 6.0 to 8.0. DSC analysis of samples from dissolution and crystallization runs indicated that insulin presents different structures. Also, insulin dissolution and crystal growth kinetics as well as nucleation rate as function of supersaturation were determined with data from these experiments