Fluoride effect on supramolecular organization of dental enamel organic extracellular matrix of mice

Abstract

A biossíntese do esmalte dentário inicia-se pela secreção, processamento proteolítico e auto-agregação de uma complexa mistura de proteínas, sintetizadas pelos ameloblastos, conhecida como matriz orgânica do esmalte. A formação desta matriz ocorre em três estágios: secreção (inicial), transição e maturação e parece ser fundamental para o controle da orientação e morfologia dos cristais de hidroxiapatita, que constituem a fase mineral do esmalte em desenvolvimento. No estágio de secreção da amelogênese, a matriz orgânica do esmalte apresenta uma organização supramolecular birrefringente, dessa forma, a referida matriz pode ser observada e quantificada por meio de microscopia de luz polarizada. Alterações genéticas e ambientais podem induzir a distúrbios na organização molecular da matriz orgânica extracellular do esmalte (MOECE) dentário no estágio secretório, gerando modificações em sua birrefringência, tais distúrbios podem contribuir para alterações na estrutura do esmalte maduro. Altos níveis de ingestão de flúor causam mudanças na estrutura e concentração das proteínas da matriz orgânica do esmalte, induzindo a falhas na mineralização e formação desorganizada dos cristais do esmalte. Estas alterações caracterizam a fluorose de esmalte e incluem aumento da porosidade, redução do conteúdo mineral e diminuição da microdureza do esmalte maduro. O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos do flúor sobre a birrefringência da MOECE no estágio secretório. Quinze camundongos da linhagem A/J foram divididos em 3 grupos e submetidos a um tratamento de 30 dias com dieta exclusiva de ração e água deionizada ad libitum. A água ingerida continha 0, 25, e 50 ppm de flúor (NaF) nos grupos A/J-Controle, A/J-Flúor 25 ppm e A/J-Flúor 50 ppm, respectivamente. Os mesmos procedimentos foram aplicados a quinze camundongos da linhagem NOD (Non Obese Diabetic), caracterizando os grupos NOD-Controle, NOD-Flúor 25 ppm e NOD-Flúor 50 ppm. Após o período acima mencionado, todos os animais foram perfundidos com uma mistura de paraformaldeído 2% com glutaral deído 0,5% em tampão fosfato 0,2 M e suas hemimaxilas foram extraídas e mantidas na mesma solução fixadora por 16h, as amostras foram então descalcificadas em mistura de ácido nítrico 5% com formaldeído 4 % por 6 h sob agitação. Após desidratação e inclusão em parafina, obtive-se cortes longitudinais de 5µm de espessura que foram desparafinizados, hidratados, montados em solução aquosa de glicerina 80% e analisados em microscopia de luz polarizada. Realizou-se a análise da matriz orgânica dos incisivos superiores de modo a se determinar o retardo óptico em nanômetros (nm) na área de maior birrefringência no estágio de secreção da amelogênese. Os valores de retardo ótico foram submetidos à análise estatística (Kruskal-Wallis) e os grupos A/J e NOD foram comparados separadamente. Observou-se um aumento, estatisticamente significante, dos valores de retardo ótico nos grupos A/J-Flúor 25 ppm e A/J-Flúor 50 ppm, quando comparados ao grupo A/J-Controle (p<0,01). O mesmo aconteceu com os grupos NOD-Flúor 25 ppm e NOD-Flúor 50 ppm que mostraram aumento, estatisticamente significante, dos valores de retardo ótico quando comparados ao grupo NOD-Controle (p<0,01). Os grupos A/J-Flúor apresentaram valores semelhantes (p>0,05) o que também ocorreu com os grupos NOD-Flúor. Os resultados do presente estudo mostram que o flúor induz a um aumento da birrefringência da MOECE no estágio de secreção, podendo estar associado ao mecanismo de desenvolvimento da fluorose de esmalteDental enamel biosynthesis begins with secretion, proteolytic processing and self-assembly of a highly complex mixture of proteins, synthesised by ameloblast, which is known as the enamel organic matrix. This matrix formation occurs at three stages: secretion (initial), transition and maturation and seems to be essential for controlling orientation and morphology of the hydroxyapatite crystals that comprise mineral phase of developing enamel. In the secretory stage of amelogenesis, the enamel organic matrix presents a birefringent supramolecular organization. Therefore, it can be observed and quantified by polarizing microscopy. Genetic and environmental alterations may induce disturbances in the molecular organization of the secretory-stage enamel organic extracellular matrix (EOECM), producing birefringence changes, these disturbances may contribute to mature enamel alterations. High levels of ingested fluoride cause modifications in the structure and concentration of proteins of the enamel organic matrix inducing failures in the mineralization and disorganized enamel crystals formation. These alterations characterize enamel fluorosis, include increased porosity, mineral content reduction and diminished mature enamel micro hardness. The aim of the present study was to analyse the effects of fluoride on the birefringence of secretory stage EOECM. Fifteen A/J inbred mice strain were divided into 3 groups and submitted to a treatment during 30 days with exclusive diet of food and deionized water ad libitum. The ingested water contained 0, 25 and 50 ppm fluoride (NaF) in the groups A/J Control, A/J 25 ppm fluoride and A/J 50 ppm fluoride, respectively. The same procedures were applied to fifteen NOD (Non Obese Diabetic) mice, which formed the groups NOD Control, NOD 25 ppm fluoride and NOD 50 ppm fluoride. After the abovementioned period, all the animals were perfused with 2% paraformaldehyde, 0.5% glutaraldehyde in 0.2 M phosphate buffered solution. Its hemimaxillae were then extracted and maintained in the same fixative solution for 16 h, the samples were decalcified under stirring in 5% nitric acid, 4% formaldehyde for 6 h. After dehydration and embedded in paraffin, longitudinal 5-µm-thick sections were obtained and deparaffined, hydrated and mounted with aqueous 80% glycerine as imbibing medium and analyzed with polarizing microscopy. Optical retardation (nm) of the area that showed the highest birefringence brightness in the EOECM of upper incisors was determined. Optical retardation values were submitted to statistical analysis (Kruskal-Wallis) and A/J and NOD groups were separately compared. An statistically significant increase in optical retardations values was observed in A/J 25 ppm Fluoride and A/J 50 ppm Fluoride, when compared to A/J Control group (p<0.01). The same happened with NOD 25 ppm Fluoride and NOD 50 ppm Fluoride groups which exhibited statistically significant increase in optical retardations values when compared to NOD Control group (p<0.01). A/J Fluoride groups presented similar optical retardation values (p>0.05) which occurred with NOD fluoride groups. The results presented here show the fluoride induces an increase in the birefringence of secretory stage EOECM, which may be associated with enamel fluorosis development. Key words: Enamel, Amelogenesis, Enamel Organic Matrix, Birefringence, Fluorid