Use of industrial by-products for inulinase production by Kluyveromyces marxianus in a fed-batch process.

Abstract

A inulinase é uma enzima importante na produção de frutose através da hidrólise enzimática da inulina e também na produção de frutooligossacarídeos. Os meios industriais para produção desta enzima são bastante complexos e alguns de seus componentes podem propiciar a formação de precipitados ao longo da etapa fermentativa. Numa primeira etapa deste trabalho, o objetivo principal foi estudar as condições de pré-tratamento de melaço de cana-de-açúcar e água de maceração de milho para viabilizar a recuperação e purificação direta do caldo fermentado contendo a enzima inulinase. As condições de pré-tratamento otimizadas foram assim definidas: 4% (p/p) de carvão ativado tipo ANFC, sob agitação de 150 rpm a 60ºC durante 10 minutos, sendo que os substratos foram tratados separadamente numa concentração de 200 g/L. Em seguida, foi estudada a produção de inulinase por Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 a partir destes meios industriais pré-tratados compostos por melaço de cana-de-açúcar (MEL) e água de maceração de milho (AMM) em reatores operando em batelada alimentada. As fermentações foram iniciadas em batelada alimentada contendo 188 g/L de AMM, 30 g/L de MEL (20 g/L de ART) e 7,5 g/L de extrato de levedura, com base nas condições otimizadas em frascos agitados. Observou-se que ocorre um aumento gradativo no pH após a exaustão da fonte de carbono contida no meio inicial, indicando a necessidade de substrato. Sendo assim, estudou-se o controle de alimentação por "feedback" pela manutenção de pH do meio a 4,5. Complementarmente, verificou-se a alimentação exponencial com base em constante cinéticas definidas em batelada simples. O processo em reator de bancada com agitação de 450 rpm (pás inclinadas), aeração de 1,5 vvm, temperatura de 36ºC e controle de pH pela alimentação de melaço 200 g/L e HCl 0,5 N atingiu uma atividade enzimática máxima igual a 974 U/mL e uma concentração de biomassa final de 31,0 g/L após 135 h. Além disso, notou-se que altos níveis de oxigênio dissolvido e baixa concentração de açúcar no meio mostraram-se como boas condições para produção de inulinase e que um pulso de etanol parece ampliar a velocidade específica de produção de inulinase por Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571.Inulinase is an important enzyme for fructose production through enzymatic hydrolysis of the inulin and also for fructoligosacharides formation. The alternative medium composed of industrial by-products as sugar-cane molasses and corn step liquor for inulinase production are complex and some of its components can produce flocculants agents during fermentative process. In a first stage of this work, the main objective was to study the conditions of pretreatment of sugar-cane molasses and corn step liquor in order to viably the downstream phase in expanded bed column. The optimized conditions of pretreatment were 4 % (w/w) activated carbon ANFC at 60 ºC, 300 rpm for 10 minutes, the industrial by-products were treated separated in a concentration of 200 g/L. After that, Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 was cultivated in fed-batch process to overproduce inulinase. The fermentation was started in batch wise on medium with 188.0 g/L of corn steep liquor, 30.0 g/L of sugar-cane molasses (20 g/L of total reduced sugar) and 7.5 g/L of yeast extract to enhance biomass concentration. After depletion of sucrose, indicated by a steep rise of pH, the fed-batch phase was initiated. The feeding strategy was applied to control pH-stat at 4.5 by the automatic addition of 200 g/L sugar-cane molasses and HCl 0.5 N. Complementarily, it was verified exponential feeding on the basis of kinetic defined in batch wise process. Fedbatch cultivation of Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 at 36 ºC, 450 rpm and 1.5 vvm resulted in a biomass concentration of 31.0 g.L-1 after 135 h. High dissolved oxygen and low sugar concentration in medium are shown to be a good condition for inulinase production and an ethanol pulse has enhanced the specific inulinase production of Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571. The inulinase activity in the fed-batch process using industrial by-products reached 974 U.mL-.