Determination of collagen degradation degree using spectroscopy

Abstract

Předložená diplomová práce se zabývá charakterizací vlastností kolagenu po působení různých fyzikálních a chemických podmínek. Jejím cílem je popsat změny struktury kolagenu způsobené jeho modifikací, zhodnotit dopad těchto změn na další použití kolagenu a výběr vhodné metody pro determinaci vlastností kolagenu. V literární rešerši je popsána chemická struktura kolagenu, jeho využití jako biomateriálu, stabilita kolagenu a způsoby určení stupně porušení nativní kolagenní struktury. V experimentální části jsou vodné roztoky hovězího kolagenu typu I modifikovány působením různých podmínek - různé intenzity a délky dezintegrace (1 minuta při 6 000 otáčkám až 5 minut při 14 000 otáčkách), různé teploty přípravy (4 °C, pokojová teplota a 30 °C), různou dobou přípravy (1 až 5 dní), působením světla (1 až 14 dní) a úpravou pH (4 až 8). Za účelem popsání struktury kolagenu a změn, k nimž došlo během modifikace kolagenních vzorků působením různých podmínek jsou kolagenní roztoky analyzovány UV VIS spektrometrií a infračervenou spektrometrií. UV-VIS spektrometrií byly analyzovány barevné produkty reakce volných aminoskupin přítomných v kolagenu s vhodným činidlem. Jako činidlo byl použit vodný roztok kyseliny 2,4,6 trinitrobenzensulfonové a roztok ninhydrinu v alkoholu. V případě FT-IR spektrometrie byly kolagenní vzorky analyzovány buď v podobě KBr tablet nebo pomocí ATR techniky v podobě filmů. Pro vyhodnocení změn ve struktuře kolagenu byla využita dekonvulace amidu I, jednoho z charakteristických pásů v infračerveném spektru kolagenu, který leží v oblasti 1590 - 1720 cm-1. Na základě snímků pořízených pomocí SEM byla porovnána morfologie kolagenních vzorků. V souladu s teoretickými předpoklady bylo zjištěno, že k nejvýraznějšímu porušení kolagenní struktury dochází při dlouhodobém stání kolagenního roztoku na světle. Podstatné změny způsobuje i zvýšení teploty a téměř žádný vliv na strukturu kolagenu nemá intenzita dezintegrace kolagenního roztoku. V případě zvýšení pH, byly vzorky do pH 5 stabilní a homogenní, ale poté docházelo k oddělení kolagenní fáze a srážení kolagenu, což ovlivnilo a zkreslilo UV-VIS analýzu. Nejlepších vlastností dosahují vzorky zamražené čerstvě po přípravě, dezintegrované 4 minuty při 14 000 otáčkách při 30 °C a beze změny pH. Na základě výsledků analýz se jako vhodné metody pro stanovení stupně porušení kolagenní struktury ukázala UV VIS spektrometrie s využitím kyseliny 2,4,6 trinitrobenzensulfonové v kombinaci s infračervenou spektrometrií kolageních filmů