The role of the extracellular matrix in the patterning and morphogenesis of the sclerotome

Abstract

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Extracellular matrices have several important functions during vertebrate development. They are responsible for polarizing cells, supporting cell migration and maintaining tissue boundaries, and also regulate cell shape, proliferation, growth and differentiation. Fibronectin is a major component of embryonic extracellular matrices and is involved in numerous processes during embryogenesis. It has recently been implicated in the formation of epithelial somites, transient structures responsible for the development of the axial skeleton, muscle and dermis. Significantly, when the assembly of the fibronectin matrix is impaired, somite formation is severely affected; moreover, somites formed before this impairment have defective morphologies. With this work, we addressed whether the blocking of fibronectin matrix assembly would have implications in the development of older somites and their derivatives, in particular the sclerotome. We found that when chick embryo whole or bisected posterior explants, including all tissues caudal to somite X, are cultured for 6 hours with a 70kDa fibronectin fragment, thus abrogating further fibronectin matrix assembly, not only is somitogenesis halted, but the morphology of all the somites is affected, suggesting a delay in somite development. Furthermore, somite patterning is also altered, as seen by a delay in the expression of Pax1, a sclerotome marker. This delay in the activation of the sclerotome identity is accompanied by a failure of its full de-epithelialization at the correct time. Moreover, the myogenic program, as visualized by MyoD expression, also fails to be activated and maintained. Together these results demonstrate that an intact fibronectin matrix is essential for both sclerotome and myotome development. Given that both of these somite compartments are patterned by the morphogen Sonic hedgehog (Shh), we investigated whether inhibiting fibronectin matrix assembly affects Shh signaling. We found that although the notochord expresses Shh normally, the expression of Patched genes, a readout of Shh signaling, is perturbed in the somites. All these results highlight the complexity of paraxial mesoderm development, and demonstrate the importance of the extracellular matrix not only as a supportive scaffold, but as an active player in somite patterning and morphogenesis.Nos Vertebrados, a mesoderme paraxial forma-se de cada lado do tubo neural como consequência da gastrulação. Este tecido é composto por células mesenquimatosas que constituem a mesoderme presomítica, cuja parte rostral sofre periodicamente uma transição mesênquima-epitélio, formando um par de sómitos epiteliais. Estes são estruturas transientes, precursores da musculatura, esqueleto axial e derme e são responsáveis pelo arranjo segmentar de várias estruturas. No embrião de galinha (Gallus gallus), um novo par de sómitos é formado a cada 90 minutos, resultando num gradiente de maturação rostro-caudal em que os sómitos anteriores são mais desenvolvidos do que os sómitos posteriores, mais recentes. A maturação do sómito resulta na formação de vários derivados. Pouco tempo após a sua formação, a parte ventral do sómito sofre uma transição epitélio-mesênquima para formar o esclerótomo, responsável pela formação das vértebras e costelas. A região dorsal do sómito mantém-se epitelial, designando-se o dermamiótomo. Na região mais mediana do sómito inicia-se a formação do miótomo, precursor do músculo esquelético axial. A formação destes derivados somíticos é dependente dos tecidos envolventes, que produzem morfogénios responsáveis pela indução dos vários tipos celulares específicos de cada derivado. Um destes morfogénios é o Sonic hedgehog (Shh), importante para inúmeros processos durante o desenvolvimento embrionário, nos quais se inclui a formação dos sómitos no intervalo de tempo correcto. O Shh é produzido pelas estruturas axiais, a notocorda e o floor plate do tubo neural, sinalizando ao sómito ventral de forma a induzir a formação do esclerótomo. É ainda um dos responsáveis pela indução do miótomo, sendo que concentrações intermédias de Shh, em conjunto com concentrações intermédias de Wnt produzido pela ectoderme, induzem a activação do programa miogénico na parte mediana do sómito. A matriz extracelular que ocupa os espaços intercelulares nos tecidos é outro componente de extrema importância no desenvolvimento embrionário. A matriz extracelular têm inúmeros papéis durante a embriogénese – além de providenciarem suporte físico às células, fornecem sinais bioquímicos e biomecânicos cruciais para a morfogénese e diferenciação dos tecidos, polarizam as células, servem de substrato à sua migração e mantêm as fronteiras entre tecidos. Variações na sua deposição, composição, rigidez e elasticidade são ainda responsáveis por regular profundamente o comportamento e a fisiologia celulares, tendo importante impacto no crescimento, sobrevivência, forma e diferenciação das células. Um dos componentes mais ubíquos das matrizes extracelulares embrionárias é a fibronectina. Esta matriz tem inúmeros papéis durante o desenvolvimento embrionário, desde a polarização das células, à separação de diferentes tecidos e ao desenvolvimento correcto da mesoderme, incluindo a mesoderme paraxial. De facto, nos modelos de ratinho, peixe-zebra e Xenopus, a ausência ou deficiência de fibronectina leva à não formação de sómitos e o mesmo é observado em embriões de galinha. Estudos anteriores no nosso laboratório demonstraram que quando explantes posteriores de embrião de galinha são cultivados na presença de um fragmento de fibronectina de 70kDa, que se liga aos domínios de ligação fibronectina-fibronectina e impede a sua fibrilogénese, o processo de somitogénese é atrasado e mais tarde parado. Para além disto, a morfologia dos sómitos formados antes do período de cultura é afectada, ficando mais desorganizada. A fibronectina é assim importante não só na polarização das células da mesoderme presomítica, de forma a formarem o sómito epitelial, como é também importante na manutenção desta estrutura ao longo do seu desenvolvimento. Para além deste efeito do bloqueio da construção da matriz de fibronectina na somitogénese e morfologia dos sómitos formados antes da cultura, foi também observado que estes sómitos não chegam a formar o esclerótomo no tempo devido. Assim, o objectivo deste projecto foi analisar a morfogénese e a padronização do esclerótomo quando a construção da matriz de fibronectina é impedida, analisando possíveis efeitos na morfologia, indução e padronização pelo Shh, e expressão de genes marcadores de diferenciação característicos do esclerótomo e do miótomo. Para o efeito, explantes posteriores de embriões de galinha de estádio HH11 a HH14, englobando os 10 sómitos mais posteriores (sómitos SI a SX) e a PSM, foram cultivados com o fragmento de 70kDa de fibronectina durante 6 horas. Para determinar se a morfologia do esclerótomo é alterada quando a construção da matriz de fibronectina é bloqueada, explantes cultivados foram processados para imunohistoquímica para N-caderina. Verificou-se que a morfologia de todos os sómitos sofre alteração, incluindo nos sómitos formados antes da cultura, sugerindo um atraso no seu desenvolvimento. A principal alteração observada foi a não de-epitelização do sómito ventral para dar formação ao esclerótomo no tempo correcto, confirmando os resultados preliminares dos estudos anteriores. Processando explantes cultivados para hibridação in situ utilizando sondas para o mRNA de marcadores específicos dos derivados somíticos, foi possível constatar que os sómitos mais anteriores mantêm a identidade de esclerótomo, confirmada pela análise da expressão do marcador Pax1. No entanto, tal como verificado para a morfologia, a activação deste gene é atrasada na ausência de uma matriz de fibronectina intacta. Assim, a matriz de fibronectina é importante não só para a activação do programa de diferenciação do esclerótomo no tempo certo, mas também para a sua correcta morfogénese mais tarde na sua maturação. Além dos efeitos da inibição da construção da matriz de fibronectina na morfogénese do esclerótomo, foi também identificada uma severa alteração no programa de miogénese. Quando cultivados com o fragmento de 70kDa de fibronectina, não só a expressão de MyoD não é activada no tempo correcto, como sómitos formados antes da cultura perdem a forte expressão de MyoD que apresentavam anteriormente. Assim, os nossos resultados sugerem que a matriz de fibronectina tem um papel determinante não só na activação mas também na manutenção do programa miogénico. Foi ainda identificado, através de hibridação in situ para os receptores e genes-alvo de Shh Patched1 e Patched2, que a sinalização Shh é afectada quando a fibrilogénese de fibronectina é impedida. Em explantes cultivados com o fragmento de 70kDa, a expressão de Patched1 nos sómitos diminui, e não chega a ser restrita à parte mediana do sómito, como acontece em explantes controlo e no embrião. Por outro lado, a alteração na expressão de Patched2 é ainda mais severa, desaparecendo da mesoderme presomítica anterior e dos sómitos, incluindo sómitos formados antes da cultura, sendo apenas mantida nos sómitos mais rostrais. Assim, embora o Shh seja produzido correctamente pelas estruturais axiais, como comprovado por hibridação in situ para Shh, o seu sinal não é recebido correctamente pelo sómito na ausência de uma matriz de fibronectina intacta. Deste modo, a sinalização de Shh parece depender directa ou indirectamente da matriz de fibronectina de modo a induzir correctamente a diferenciação e morfogénese dos sómitos. É possível que a alteração na matriz de fibronectina tenha um papel na difusão, restrição ou apresentação da molécula de Shh aos tecidos alvo. Por outro lado, a alteração na sua construção pode levar a alterações noutros componentes da matriz extracelular que por sua vez interajam com o Shh como, por exemplo, a laminina ou proteoglicanos. Os resultados deste projecto demonstram assim a importância da matriz extracelular não só como estrutura de suporte, mas também como tendo um papel directo e crucial na padronização e morfogénese dos sómitos e seus derivados