Plataforma modular de vacunas de subunidad como estrategia de vacunación oral antiviral para peces de cultivo

Les malalties virals que impacten l'aqüicultura necessiten ser controlades de manera barata i eficientment. La vacunació és la principal eina preventiva per combatre malalties virals altament infeccioses que afecten els peixos de cultiu. En aquest estudi, presentem una innovadora plataforma modular recombinant de vacunes de subunitat per a administració oral, nanoestructurades com a cossos d'inclusió (IBs, Inclusion bodies). Les plataformes modulars inclouen la proteïna antigènica recombinant del virus unida a un His-tag a la part C-terminal. A més, per l'extrem N-terminal unim l'antigen viral recombinant amb un pèptid espaiador a un Interferó gamma recombinant com a adjuvant per avaluar si el domini IFN indueix un augment de la resposta immune. De la mateixa manera, unim l'antigen viral amb IFN a una seqüència lligant, per avaluar si el lligand seleccionat té el potencial de dirigir la vacuna a cèl·lules o òrgans de rellevància immunològica, i estimular una resposta immune local i/o sistèmica. Per a l'estudi, seleccionem el virus de la virèmia primaveral que afecta la carpa (SVCV) i el virus de la necrosi pancreàtica infecciosa que afecta salmònids (IPNV), espècies que en conjunt representen prop del 86% de la producció total de peixos cultivats a nivell mundial. Per primera vegada, dissenyem i produïm proteïnes recombinants nanoestructurades de la glicoproteïna G3 de SVCV, G3 de SVCV unit a IFN[Gamma] (SVCV-IFN), proteïna VP2 d'IPNV unit a IFN[Gamma] (IPNV-IFN) i VP2 d'IPNV unit a IFN[Gamma] lligant CCR5 (IPNV-IFN-CCR5). Realitzem la caracterització morfològica de les plataformes modulars per microscòpia electrònica d'escombrada (FESEM) i demostrem que les nanoestructures són internalitzades per cèl·lules hepàtiques de peix zebra (ZFL), per cultius primaris de macròfags de ronyó anterior de truita arcoiris (RT-HKM) i per cèl·lules d'intestí de truita (RTgutGC), mitjançant citometria de flux i microscòpia confocal. A nivell in vitro, els mòduls nanoestructurats van induir l'expressió de gens associats a la immunitat innata a cèl·lules de ZFL, RTgutGC i RT-HKM. En experiments in vivo amb larves de peix zebra (D. rerio) demostrem que els nanopellets SVCV i SVCV-IFN fluorescents són absorbits a nivell intestinal i en pàncrees. A més, demostrem que els peixos zebra adults vacunats amb SVCV-IFN i desafiats amb el virus SVC, presenten un excel·lent nivell de protecció, indicant el potencial adjuvant del mòdul IFN[Gamma]. En assaigs in vivo amb truita arcoiris (O. mykiss) administrats per intubació oral, demostrem que els nanopellets IPNV i IPNV-IFN fluorescents són absorbits en el tracte intestinal, biodistribuïts al ronyó anterior i endocitats per macròfags del ronyó. En experiments in vivo, truites juvenils van ser intubades de forma oral amb IPNV-IFN i IPNV-IFN-CCR5 i vam observar l'expressió de marcadors de gens de resposta immune en intestí posterior, melsa i macròfags del ronyó anterior el dia 1, 3, 15 i 21 després de la intubació. A més, sèrums obtinguts 21 dies post intubació amb el mòdul lligand (IPNV-IFN-CCR5) van mostrar una inducció significativa d'anticossos específics del virus IPN en comparació a IPNV-IFN i els grups control, cosa que podria indicar que el lligand CCR5 pot estar promovent la migració cel·lular i conseqüentment la inducció d'anticossos específics del virus d'IPN. Els resultats en conjunt mostren que les vacunes orals de subunitat que inclouen els mòduls interferó gamma i/o lligant poden estimular la resposta immune innata-adaptativa i protegir els peixos contra el virus de SVC i IPN.Las enfermedades virales que impactan la acuicultura necesitan ser controladas de forma barata y eficientemente. La vacunación es la principal herramienta preventiva para combatir enfermedades virales altamente infecciosas que afectan a los peces de cultivo. En este estudio, presentamos una innovadora plataforma modular recombinante de vacunas de subunidad para administración oral, nanoestructuradas como cuerpos de inclusión (IBs, Inclusion bodies). Las plataformas modulares incluyen la proteína antigénica recombinante del virus unida a un His-tag en la parte C-terminal. Además, por el extremo N-terminal unimos el antígeno viral recombinante con un péptido espaciador a un Interferón gamma recombinante como adyuvante para evaluar si el dominio IFN induce un aumento de la respuesta inmune. De la misma forma, unimos el antígeno viral con IFN a una secuencia ligando, para evaluar si el ligando seleccionado tiene el potencial de dirigir la vacuna a células u órganos de relevancia inmunológica, y estimular una respuesta inmune local y/o sistémica. Para el estudio, seleccionamos el virus de la viremia primaveral que afecta a la carpa (SVCV) y el virus de la necrosis pancreática infecciosa que afecta a salmónidos (IPNV), especies que en conjunto representan cerca del 86% de la producción total de peces cultivados a nivel mundial. Por primera vez, diseñamos y producimos proteínas recombinantes nanoestructuradas de la glicoproteína G3 de SVCV, G3 de SVCV unido a IFN[Gamma] (SVCV-IFN), proteína VP2 de IPNV unido a IFN[Gamma] (IPNV-IFN) y VP2 de IPNV unido a IFN[Gamma] y un ligando CCR5 (IPNV-IFN-CCR5). Realizamos la caracterización morfológica de las plataformas modulares por microscopia electrónica de barrido (FESEM) y demostramos que las nanoestructuras son internalizadas por células hepáticas de pez cebra (ZFL), por cultivos primarios de macrófagos de riñón anterior de trucha arcoíris (RT-HKM) y por células de intestino de trucha (RTgutGC), mediante citometría de flujo y microscopia confocal. A nivel in vitro, los módulos nanoestructurados indujeron la expresión de genes asociados a la inmunidad innata en células de ZFL, RTgutGC y RT-HKM. En experimentos in vivo con larvas de pez cebra (D. rerio) demostramos que los nanopellets SVCV y SVCV-IFN fluorescentes son absorbidos a nivel intestinal y en páncreas. Además, demostramos que los peces cebra adultos vacunados con SVCV-IFN y desafiados con el virus SVC, presentan un excelente nivel de protección, indicando el potencial adyuvante del módulo IFN[Gamma]. En ensayos in vivo con trucha arcoíris (O. mykiss) administrados por intubación oral, demostramos que los nanopellets IPNV e IPNV-IFN fluorescentes son absorbidos en el tracto intestinal, biodistribuidos al riñón anterior y endocitados por macrófagos del riñón. En experimentos in vivo, truchas juveniles fueron intubadas de forma oral con IPNV-IFN e IPNV-IFN-CCR5 y observamos la expresión de marcadores de genes de respuesta inmune en intestino posterior, bazo y macrófagos del riñón anterior el día 1, 3, 15 y 21 después de la intubación. Además, sueros obtenidos 21 días post intubación con el módulo ligando (IPNV-IFN-CCR5) mostraron una inducción significativa de anticuerpos específicos del virus IPN en comparación a IPNV-IFN y los grupos control, lo que podría indicar que el ligando CCR5 puede estar promoviendo la migración celular y consecuentemente la inducción de anticuerpos específicos del virus de IPN. Los resultados en conjunto muestran, que las vacunas orales de subunidad que incluyen los módulos interferón gamma y/o ligando pueden estimular la respuesta inmune innata-adaptativa y proteger a los peces contra el virus de SVC e IPN.It is of great importance to control viral diseases affecting aquaculture in an efficient and cost-effective manner. Vaccination represents the primary preventive measure against highly infectious viral diseases that affect farmed fish. This study presents an innovative recombinant modular platform of subunit vaccines for oral administration, nanostructured as inclusion bodies (IBs). The modular platforms include the recombinant antigenic virus protein bound to a His-tag at the C-terminal part. Furthermore, at the N-terminal end, we have attached the recombinant viral antigen with a spacer peptide to a recombinant gamma interferon as an adjuvant in order to assess whether the IFN domain induces an increase in the immune response. Similarly, we have attached the viral antigen with IFN to a ligand sequence in order to assess whether the selected ligand has the potential to target the vaccine to immunologically relevant cells or organs, and to stimulate a local and/or systemic immune response. The study selected two viral pathogens affecting fish: spring viraemia virus affecting carp (SVCV) and infectious pancreatic necrosis virus affecting salmonids (IPNV). These two pathogens collectively account for approximately 86% of the total production of farmed fish worldwide. For the first time, we designed and produced nanostructured recombinant proteins of SVCV G3 glycoprotein (SVCV), SVCV G3 bound to IFN[Gamma] (SVCV-IFN), IPNV VP2 protein bound to IFN[Gamma] (IPNV-IFN) and IPNV VP2 bound to IFN[Gamma] and a CCR5 ligand (IPNV-IFN[Gamma]-CCR5). Morphological characterisation of the modular platforms was performed by scanning electron microscopy (FESEM), which demonstrated that the nanostructures are internalised by zebrafish liver cells (ZFL), by primary cultures of rainbow trout anterior kidney macrophages (RT-HKM) and by trout intestine cells (RTgutGC). This was achieved by flow cytometry and confocal microscopy. In vitro, the nanostructured modules induced the expression of innate immunity-associated genes in ZFL, RTgutGC and RT-HKM cells. In vivo experiments with zebrafish (D. rerio) larvae demonstrated that fluorescent SVCV and SVCV-IFN nanopellets are taken up in the intestine and pancreas. Furthermore, we demonstrate that adult zebrafish vaccinated with SVCV-IFN and challenged with SVC virus exhibit an excellent level of protection, indicating the adjuvant potential of the IFN[Gamma] module. In in vivo assays with rainbow trout (O. mykiss) administered by oral intubation, we demonstrate that fluorescent IPNV and IPNV-IFN nanopellets are absorbed in the intestinal tract, biodistributed to the anterior kidney and endocytosed by kidney macrophages. In vivo experiments were conducted on juvenile trout, which were orally intubated with IPNV-IFN and IPNV-IFN-CCR5. The expression of immune response gene markers was observed in hindgut, spleen and anterior kidney macrophages at days 1, 3, 15 and 21 post-intubation. Furthermore, sera obtained 21 days post-intubation with the ligand module (IPNV-IFN-CCR5) demonstrated a significant induction of IPN virus-specific antibodies in comparison to IPNV-IFN and control groups. This suggests that the CCR5 ligand may be promoting cell migration and consequently the induction of IPN virus-specific antibodies. In conclusion, the results demonstrate that oral subunit vaccines comprising gamma interferon and/or ligand modules can elicit an innate-adaptive immune response and protect fish against SVC and IPN virus

Enhancing recombinant adeno-associated virus (rAAV) production through cell and gene engineering

La teràpia gènica representa una revolució dins les teràpies emergents, amb l'objectiu de corregir o contrarestar mutacions genètiques i les seves malalties associades a través de la introducció, modificació o supressió de gens específics en les cèl·lules d'un individu. Els virus adenoassociats recombinants (rAAVs) han sorgit com a vectors altament efectius per a aquesta finalitat, amb diverses teràpies basades en rAAVs ja aprovades per tractar malalties rares, augmentant la seva demanda en qualitat clínica. No obstant això, la complexitat dels mètodes de producció de rAAVs i la falta de processos de fabricació robustos incrementen els costos de les teràpies gèniques, restringint l'accés dels pacients a aquests tractaments i dificultant la seva aplicació en malalties més comunes. Per abordar aquests desafiaments, s'investiguen les limitacions en la producció de rAAVs i es proposen modificacions cel·lulars i genètiques per avançar en el desenvolupament de teràpies basades en rAAVs, especialment en rAAV9 i rAAV1. Aquesta anàlisi es divideix en dues parts principals. La primera part es centra en el desenvolupament d'estratègies d'optimització de la producció de rAAVs mitjançant l'expressió genètica transitòria (TGE). Encara que actualment la triple transfecció (TT) en cèl·lules HEK293 és una de les plataformes dominants per a la producció de rAAVs, la seva implementació presenta limitacions significatives, per aquest motiu, s'exploren mètodes alternatius per a la seva millora. En treballs anteriors, el mètode d'expressió genètica extesa (EGE) es va desenvolupar com una eina prometedora per millorar la producció de rAAVs, ja que permet superar la producció obtinguda pel mètode de TT, recollint els rAAVs en el medi extracel·lular, eliminant la necessitat de lisi cel·lular. Al Capítol u, el mètode de producció de rAAVs per TT es compara amb el mètode d'EGE a nivell molecular utilitzant proteòmica quantitativa. La comparació de l'expressió proteica diferencial i els processos moleculars de les cèl·lules HEK293 entre les dues metodologies de producció proporciona un anàlisi detallat sobre cada estat cel·lular, permetent identificar possibles limitacions que afectin el mètode TT de producció de rAAVs i possibles dianes per a l'enginyeria racional de línies cel·lulars. Al Capítol dos, s'utilitzen les dianes identificades per a l'enginyeria metabòlica de cèl·lules hoste, per millorar l'obtenció d'AAVs a la fracció extracel·lular. A més, s'estudia la suplementació del medi per mitigar els efectes negatius de l'alta densitat cel·lular sobre l'eficiència de transfecció. Al Capítol tres, s'estudia l'expressió del gen adenoviral E1A durant la producció de rAAVs en cèl·lules HEK293 com una possible limitació per a la producció de vectors virals. Es caracteritza la dinàmica d'expressió dels nivells d'E1A durant la producció de rAAVs i es proposen estratègies per preservar la seva expressió, millorant així la producció. La segona part, que comprèn els capítols quatre i cinc, se centra en explorar estratègies per a la prova de concepte d'un sistema d'expressió genètica estable (SGE) de producció de rAAVs, avaluant l'ús de diferents línies cel·lulars com a sistemes productors. Per això, s'empren tècniques d'enginyeria genètica per a l'expressió induïble basada en el sistema Tet-On, juntament amb l'eina de Disseny d'Experiments (DoE) per desenvolupar i optimitzar els mètodes de producció de rAAVs. Al Capítol quatre, s'explora un primer pas cap al mètode SGE basat en l'expressió del gen rep de forma induïble utilitzant una línia cel·lular que conté el gen adenoviral E1, com la cèl·lula HEK293. El Capítol cinc es centra en l'avaluació de línies cel·lulars alternatives per la producció de rAAVs. De forma global, els resultats presentats en aquesta tesi contribueixen al desenvolupament d'estratègies de producció de rAAVs més eficients i amb menors costos, utilitzant tant plataformes d'expressió genètica transitòria com de línies cel·lulars estables.La terapia génica representa una revolución dentro de las terapias emergentes, con el objetivo de corregir o mitigar mutaciones genéticas y sus enfermedades relacionadas a través de la introducción, alteración o eliminación de genes específicos en las células de un individuo. Los virus adenoasociados recombinantes (rAAVs) han surgido como vectores altamente efectivos para esta finalidad, con varias terapias basadas en rAAVs ya aprobadas para tratar enfermedades raras, aumentando la demanda de rAAVs de calidad clínica. No obstante, la complejidad de los métodos de producción de rAAVs y la falta de procesos de fabricación robustos eleva los costos de las terapias génicas, restringiendo el acceso de los pacientes a estos tratamientos y dificultando su aplicación en enfermedades más comunes. Para abordar estos desafíos, se investigan las limitaciones en la producción de rAAVs y se proponen modificaciones celulares y genéticas para avanzar en el desarrollo de terapias basadas en rAAVs, especialmente en rAAV9 y rAAV1. Este análisis se divide en dos partes principales. La primera parte, se centra en el desarrollo de estrategias de optimización para mejorar la producción de rAAVs mediante la expresión génica transitoria (TGE). Aunque actualmente la triple transfección (TT) en células HEK293 es una de las plataformas dominantes para la producción de rAAVs, su implementación presenta limitaciones significativas, por ese motivo, se exploran métodos alternativos. En trabajos anteriores, el método de expresión génica extendida (EGE) se desarrolló como una herramienta prometedora para mejorar la producción de rAAVs, permitiendo superar la producción obtenida por el método de TT, recogiendo los rAAVs del medio extracelular, eliminando la necesidad de lisis celular. En el Capítulo uno, el método de producción de rAAVs por TT se compara con el método de EGE a nivel molecular empleando proteómica cuantitativa. La comparación de la expresión proteica diferencial y los procesos moleculares alterados entre las dos metodologías de producción de las células HEK293, proporciona un análisis detallado sobre cada estado celular, permitiendo identificar posibles limitaciones que afectan el método de producción por TT y dibujando posibles objetivos para la ingeniería racional de líneas celulares. En el Capítulo dos, se utilizan las dianas identificadas para mejorar la obtención de rAAVs en la fracción extracelular a través de ingeniería metabólica en las células huésped. Además, se estudia la suplementación del medio para mitigar los efectos negativos de la alta densidad celular sobre la eficiencia de transfección. En el Capítulo tres, se estudia la expresión del gen adenoviral E1A durante la producción de rAAVs en células HEK293 como una posible limitación para la producción de vectores virales. Se caracteriza la dinámica de expresión de los niveles de E1A durante la producción de rAAVs y se proponen estrategias para preservar su expresión, mejorando así la producción. La segunda parte, que comprende los capítulos cuatro y cinco, se centra en desarrollar estrategias hacia la prueba de concepto para un método de expresión génica estable (SGE) de producción de rAAVs, evaluando el uso de diferentes líneas celulares como sistemas productores. Para ello, se emplean técnicas de ingeniería génica para la expresión génica inducible basada en el sistema Tet-On, junto con la herramienta de Diseño de Experimentos (DoE). En el Capítulo cuatro, se explora la expresión del gen rep de forma inducible usando las células HEK293, que contienen el gen adenoviral E1. El Capítulo 5 se centra en la evaluación de líneas celulares alternativas para la producción de rAAVs. En general, los resultados presentados en esta tesis contribuyen al desarrollo de estrategias de producción de rAAVs más eficientes y con menores costos, utilizando tanto plataformas de expresión génica transitoria como de líneas celulares estables.Gene therapy represents a transformative therapeutical innovation, aiming to correct or counteract genetic mutations and their associated pathologies by introducing, modifying, or suppressing specific genes within an individual's cells. In recent years, recombinant adeno-associated viruses (rAAVs) have emerged as one of the most promising vectors for gene therapy applications and several rAAV-based therapies have been approved, particularly for the treatment of orphan diseases, increasing the demand of clinical-grade rAAV material. However, the complexity of rAAV production methods and the lack of robust scale-up current manufacturing processes, limits the capacity to produce rAAVs at the volumes required for clinical applications in a cost-effective manner. Consequently, the high cost of these products limits patient access to gene therapies, hindering the transition to treatments for prevalent diseases. These challenges are addressed in this thesis by investigating the rAAV production bottlenecks and proposing cellular and genetic modifications to advance into the development of rAAV-based therapies, giving specific interest to rAAV9 and rAAV1. This is addressed in two main parts. The first part, comprising Chapters one, two and three, focuses on the development of optimization strategies to improve rAAV production through transient gene expression (TGE). Although triple transfection (TT) into HEK293 cells is one of the dominant rAAV production platform nowadays, its robust application is limited, and different approaches are explored to improve it. In previous work, the extended gene expression (EGE) method was developed as a promising tool to enhance rAAV production, by enabling the continuous harvest of the secreted rAAV fraction, outperforming the TT, thereby eliminating the need of cell lysis. In Chapter one, the conventional TT method is compared to the EGE approach of rAAV production at a molecular level using a proteomic quantitative approach. The comparison of differential protein expression and enriched molecular processes of HEK293 cells between the two production methodologies provides insights into each cellular state, allowing to identify putative bottlenecks affecting the TT method of rAAV production and potential targets for rational engineering of host mammalian cell lines. These targets are used for host cell metabolic engineering in Chapter two, to enhance the rAAV harvest in the supernatant fraction. Additionally, media supplementation feeds are developed to mitigate the impact of cell density on transfection efficiency, which typically declines at higher cell concentrations limiting rAAV production by the TT method at large scale. In Chapter three, the dynamics in adenoviral E1A gene expression in HEK293 cells during rAAV production is studied as a potential constrain for viral vector production. The E1A levels in a standard rAAV production system are characterized and different strategies to preserve its expression, thereby enhancing rAAV production, are proposed. The second part, comprising Chapters four and five, focuses on developing strategies towards the proof of concept for a stable gene expression (SGE) method of rAAV production, evaluating different cell lines as hosts. Gene engineering techniques for inducible gene expression based on the Tet-On system are employed alongside the Design of Experiments (DoE) tool to develop and optimize rAAV production methods. In Chapter four, a first step towards the SGE method using an adenoviral E1-containing cell line such as HEK293 is explored, based on a stepwise engineering approach for inducible rep gene expression. Chapter five is focused on the evaluation of alternative cell lines for rAAV production. Overall, the results presented in this thesis contribute to the development of more efficient and cost-effective rAAV production strategies, using both transient gene expression and stable cell line production platforms

Base genética de la coloración de la pulpa de melón

Al fruit de meló, la coloració de la polpa pot ser blanca, verda o taronja, depenent de l'acumulació de clorofil·les i/o carotenoides. Aquest caràcter està determinat per dos gens: Green flesh (Gf) i White flesh (Wf), essent Gf epistàtic sobre Wf. Mentre que Gf és el responsable de la coloració taronja de la polpa, Wf és el principal determinant de la coloració blanca i verda, sent la blanca dominant sobre la verda. El gen Gf, localitzat al cromosoma 9, és MELO3C005449, també conegut com ORANGE (CmOr). La presència de l'al·lel dominant de Gf (CmOrHis) comporta l'acumulació de [Beta]-carotè i, per tant, la coloració ataronjada de la polpa del fruit. La identitat del gen Wf encara no es coneix, encara que s'han proposat diversos candidats. Prèviament al nostre estudi, es van creuar les varietats de meló de polpa blanca Piel de Sapo (PS, gf gf / Wf Wf) i polpa taronja Vedrantais (VED, Gf Gf / wf wf) i es va generar una col·lecció de línies consanguínies recombinants (RILs ) que van permetre identificar un QTL al cromosoma 8, denominat LUMQU8.1, associat amb la coloració blanca i verda del fruit. Mitjançant diferents abordatges com el mapeig fi del QTL LUMQU8.1 i experiments d'expressió transitòria a Nicotiana benthamiana de gens candidats presents a l'interval vam aconseguir identificar el gen corresponent a Wf. La generació i caracterització de les línies transgèniques d'Arabidopsis thaliana sobreexpressores dels al·lels de PS i VED per a Wf va permetre determinar que la variant de PS per a Wf està implicada en la repressió de la síntesi de clorofil·les i el desenvolupament de cloroplasts, presentant aquestes línies una desetiolació més lenta i un gran impacte en l'expressió de gens relacionats amb la fotosíntesi respecte a les línies sobreexpressores de l'al·lel de VED i el control sense transformar (Col-0). Mitjançant un assaig de marcatge per proximitat (TurboID) amb les variants de PS i VED per a Wf a N. benthamiana vam trobar que Wf interacciona amb una xaperona citosòlica implicada en el transport i acoblament de proteïnes a la membrana externa del cloroplast. A partir d'aquesta informació hem elaborat un model de regulació molecular de la coloració de la polpa del fruit del meló. Els fruits de meló són blancs durant els primers estadis de desenvolupament i presenten plastos amb estructures membranoses poc diferenciades. Als melons de polpa taronja, la variant CmOrHis indueix la síntesi de carotenoides i la diferenciació de cromoplasts. Als fruits que no tenen la variant CmOrHis, els fruits madurs seran blancs o verds depenent de la variant de Wf, l'expressió dels quals s'indueix amb els primers canvis de color associats a la diferenciació d'amiloplasts (blancs) o cloroplasts (verds). Als melons blancs, la variant activa PS-Wf actua reprimint l'acció de gens implicats en la síntesi de clorofil·les i el desenvolupament de cloroplasts. En els fruits de varietats verdes, la variant VED-Wf en no ser funcional és incapaç de reprimir aquests gens, els quals fan la seva funció i indueixen al desenvolupament de cloroplasts.En el fruto de melón, la coloración de la pulpa puede ser blanca, verde o naranja, dependiendo de la acumulación de clorofilas y/o carotenoides. Este carácter está determinado por dos genes: Green flesh (Gf) y White flesh (Wf), siendo Gf epistático sobre Wf. Mientras que Gf es el responsable de la coloración naranja de la pulpa, Wf es el principal determinante de la coloración blanca y verde, siendo la blanca dominante sobre la verde. El gen Gf, localizado en el cromosoma 9, es MELO3C005449, también conocido como ORANGE (CmOr). La presencia del alelo dominante de Gf (CmOrHis) conlleva la acumulación de [Beta]-caroteno y, por tanto, la coloración anaranjada de la pulpa del fruto. La identidad del gen Wf no se conoce aún, aunque se han propuesto varios candidatos. Previamente a nuestro estudio, se cruzaron las variedades de melón de pulpa blanca Piel de Sapo (PS, gf gf / Wf Wf) y pulpa naranja Vedrantais (VED, Gf Gf / wf wf) y se generó una colección de líneas consanguíneas recombinantes (RILs) que permitieron identificar un QTL en el cromosoma 8, denominado LUMQU8.1, asociado con la coloración blanca y verde del fruto. Mediante distintos abordajes como el mapeo fino del QTL LUMQU8.1 y experimentos de expresión transitoria en Nicotiana benthamiana de genes candidatos presentes en el intervalo conseguimos identificar el gen correspondiente a Wf. La generación y caracterización de las líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana sobreexpresoras de los alelos de PS y VED para Wf permitió determinar que la variante de PS para Wf está implicada en la represión de la síntesis de clorofilas y el desarrollo de cloroplastos, presentando estas líneas una desetiolación más lenta y un gran impacto en la expresión de genes relacionados con la fotosíntesis respecto a las líneas sobreexpresoras del alelo de VED y el control sin transformar (Col-0). Mediante un ensayo de marcaje por proximidad (TurboID) con las variantes de PS y VED para Wf en N. benthamiana encontramos que Wf interacciona con una chaperona citosólica implicada en el transporte y ensamblaje de proteínas a la membrana externa del cloroplasto. A partir de esta información hemos elaborado un modelo de regulación molecular de la coloración de la pulpa del fruto del melón. Los frutos de melón son blancos durante los primeros estadios de desarrollo y presentan plastos con estructuras membranosas poco diferenciadas. En los melones de pulpa naranja, la variante CmOrHis induce la síntesis de carotenoides y la diferenciación de cromoplastos. En los frutos que carecen de la variante CmOrHis, los frutos maduros serán blancos o verdes dependiendo de la variante de Wf, cuya expresión se induce con los primeros cambios de color asociados a la diferenciación de amiloplastos (blancos) o cloroplastos (verdes). En los melones blancos, la variante activa PS-Wf actúa reprimiendo la acción de genes implicados en la síntesis de clorofilas y el desarrollo de cloroplastos. En los frutos de variedades verdes, la variante VED-Wf al no ser funcional es incapaz de reprimir estos genes, los cuales realizan su función e inducen al desarrollo de cloroplastos.Fruit flesh color in melon can be white, green or orange, depending on the accumulation of chlorophylls and/or carotenoids. This character is determined by two genes: Green flesh (Gf) and White flesh (Wf), being Gf epistatic over Wf. While Gf is responsible of orange flesh color, Wf is the main determinant of white and green coloration, with white being dominant over green. The Gf gene, located on chromosome 9, is MELO3C005449, also known as ORANGE (CmOr). The dominant allele of Gf (CmOrHis) leads to [Beta]-carotene accumulation and, therefore, the orange fruit flesh color. Wf identity is still unknown, although several candidates have been proposed. Prior to our study, the white-fleshed melon variety Piel de Sapo (PS, gf gf / Wf Wf) and the orange-fleshed Vedrantais (VED, Gf Gf / wf wf) were crossed to generate a recombinant inbred line (RILs) collection, which allowed to identify a QTL on chromosome 8, called LUMQU8.1, associated with white and green flesh color. In the first part of this thesis, different approaches such as fine mapping of LUMQU8.1 and transient expression experiments in Nicotiana benthamiana of candidate genes present in the interval led to the identification of Wf. The generation and characterization of the Arabidopsis thaliana transgenic lines overexpressing the PS and VED alleles of Wf allowed us to determine that PS variant of Wf is involved in the repression of chlorophyll biosynthesis and chloroplast development, this line present a slower deetiolation and a large impact on photosynthesis-related genes expression compared to VED overexpressors and the untransformed control (Col-0). Using a proximity labeling assay (TurboID) with the PS and VED variants for Wf in N. benthamiana we found that Wf interacts with a cytosolic chaperone involved in protein transport and assembly to the chloroplast outer membrane. From this information we have developed a molecular regulation model of fruit flesh color in melon. During the first stages of development, melon fruits are white and have plastids with poorly differentiated membranous structures. In orange-fleshed melons, the CmOrHis variant induces carotenoid synthesis and chromoplast differentiation. In fruits lacking the CmOrHis variant, mature fruits will be white or green depending on the Wf variant, which expression is induced with first color changes associated with amyloplasts (white) or chloroplasts (green) differentiation. In white melons, the active variant of PS-Wf acts by repressing the action of genes involved in chlorophyll biosynthesis and chloroplast development. In green fruit varieties, VED-Wf variant, as it is non-functional, is unable to repress these genes, which carry out their function and induce the development of chloroplasts

Deep learning applied to brain MRI data for patient stratification and prediction of multiple sclerosis disease course

L'esclerosi múltiple és una malaltia crònica del sistema nerviós central caracteritzada per la inflamació, la desmielinització i la neurodegeneració. L'esclerosi múltiple és una de les principals causes no traumàtiques de discapacitat irreversible en adults joves, la qual presenta un curs altament variable entre individus. En la pràctica clínica, l'ús d'imatges de ressonància magnètica ha esdevingut una eina essencial en la diagnosi i prognosi de l'esclerosi múltiple. En els últims anys, la combinació de models basats en l'aprenentatge profund (deep learning) amb imatges de ressonància magnètica ha presentat resultats prometedors en l'estudi de l'esclerosi múltiple. No obstant això, les característiques predictives subjacents de la progressió de l'esclerosi múltiple encara són desconegudes. En aquesta tesi doctoral, qüestionem si els mètodes d'aprenentatge profund aplicats únicament a l'anàlisi de imatges cerebrals de ressonància magnètica poden ser utilitzats per predir diferents estats del curs de la malaltia en pacients amb esclerosi múltiple i, com podrien ser aplicats en la pràctica clínica. Per aconseguir aquest objectiu, presentem dues aproximacions per a l'estratificació de pacients amb esclerosi múltiple: dos estudis d'anàlisis transversals i un estudi de pronòstic. Per a cada proposta, incloem estratègies d'interpretació per a que els models d'aprenentatge profund siguin més explicatius i fiables des d'un punt de vista clínic. Tots els experiments que composen aquesta tesi doctoral han estat realitzats amb una cohort interna de pacients amb esclerosi múltiple seguits prospectivament en el temps després del seu primer brot desmielinitzant. En el primer estudi, vam proposar un model d'aprenentatge profund per a l'estratificació binària de pacients amb esclerosi múltiple en funció de la seva puntuació de discapacitat avaluada per un neuròleg. El model presentat, únicament pren com a entrada imatges de ressonància magnètica cerebral en un únic punt temporal en qualsevol estat del curs de la malaltia. En avaluar la interpretació dels resultats obtinguts mitjançant mapes d'atenció, vàrem observar una major importància en el còrtex frontotemporal i el cerebel en el desenvolupament de l'acumulació de discapacitat. En el següent estudi, vàrem analitzar l'ús del mateix model d'aprenentatge profund utilitzant diferents dades d'entrada regionals, prèviament definides, per a comparar-les amb l'entrada global de tot el cervell. Aquestes regions incloïen els teixits de matèria blanca i matèria grisa, els ventricles laterals, el cerebel i tronc cerebral i les estructures subcorticals de matèria grisa. Tot i que el model regional de matèria grisa va obtenir el millor rendiment, en avaluar els models en un conjunt de dades d'una cohort externa, es va suggerir que l'enfocament global oferia un millor rendiment i més robust per a la generalització. Finalment, vam proposar un model de supervivència en temps discret per predir la probabilitat de desenvolupar una primera progressió independent de l'activitat de brots (PIRA, per les sigles en anglès) a partir de la primera ressonància magnètica del cervell després del primer brot desmielinitzant. Amb els resultats obtinguts, vam ser capaços de millorar el poder predictiu d'un model de supervivència clàssic construït amb el predictor de PIRA més rellevant, l'edat en el primer brot. En aquesta tesi doctoral, hem desenvolupat amb èxit models d'aprenentatge profund precisos i automatitzats amb el suport d'algoritmes d'interpretació que intenten revelar quines regions en el cervell dirigeixen les decisions obtingudes a partir del model. Aquest treball marca els passos inicials de potencials models predictius destinats a millorar la gestió dels pacients amb esclerosi múltiple, aplanant el camí cap a la seva potencial integració en la pràctica clínica en el futur.La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica del sistema nervioso central caracterizada por la inflamación, la desmielinización y la neurodegeneración. La EM es una de las principales causas no traumáticas de discapacidad irreversible en adultos jóvenes y cuyo curso de la enfermedad varía ampliamente entre individuos. En la práctica clínica, el uso de imágenes de resonancia magnética (RM) ha acontecido una herramienta esencial en el diagnóstico y pronóstico de la EM. En los últimos años, la combinación de modelos basados en aprendizaje profundo (deep learning) con imágenes de RM ha presentado resultados prometedores en el estudio de la EM. Sin embargo, las características predictivas subyacentes de la progresión de la EM aún son desconocidas. En esta tesis doctoral, cuestionamos si los modelos de aprendizaje profundo aplicados únicamente al análisis de imágenes cerebrales de RM pueden utilizarse para predecir diferentes estados del curso de la enfermedad en pacientes con EM y su potencial aplicabilidad en la práctica clínica. Para lograr este objetivo, presentamos dos aproximaciones diferentes para la estratificación de pacientes con EM en estudios transversales y un estudio de pronóstico. Para cada propuesta, incluimos estrategias de interpretación para que los modelos de aprendizaje profundo sean más explicativos y fiables des de un punto de vista clínico. Todos los experimentos que componen esta tesis doctoral han sido realizados con una cohorte interna de pacientes con EM seguidos prospectivamente en el tiempo después de su primer brote desmielinizante. En el primer estudio, propusimos un modelo de aprendizaje profundo para la estratificación binaria de pacientes con EM en función de su puntuación de discapacidad evaluada por un neurólogo. El modelo propuesto toma como únicos datos de entrada imágenes de RM cerebral tomadas en un único punto temporal en cualquier estado del curso de la enfermedad. Al evaluar la interpretación de los resultados obtenidos mediante mapas de atención, observamos una mayor importancia en la corteza frontotemporal y el cerebelo en el desarrollo de la acumulación de discapacidad. En el siguiente estudio, analizamos el uso del mismo modelo de aprendizaje profundo utilizando diferentes datos regionales de entrada, predefinidos, para compararlos con la entrada global de todo el cerebro. Estas regiones incluyeron los tejidos de sustancia blanca y gris, los ventrículos laterales, el cerebelo y el tronco cerebral, y las estructuras subcorticales de sustancia gris. A pesar de que el modelo regional de sustancia gris obtuvo el mejor rendimiento, al evaluar los modelos en una cohorte externa, los resultados sugirieron que una entrada global ofrece un mayor y más robusto rendimiento para la generalización del modelo. Finalmente, propusimos un modelo de supervivencia en tiempo discreto para predecir la función de supervivencia de pacientes con un primer brote desmielinizante que desarrollarán un primer evento de progresión independiente de la actividad de brotes (PIRA, por sus siglas en inglés), utilizando la primera RM de cerebro adquirida después del primer brote desmielinizante. Con los resultados obtenidos, pudimos mejorar el poder predictivo de un modelo de supervivencia clásico usando como covariante la edad en el momento del primer brote, conocido como el predictor de PIRA más relevante. En esta tesis doctoral, hemos desarrollado con éxito modelos de aprendizaje profundo precisos y automatizados respaldados por algoritmos de interpretabilidad con el objetivo de revelar las regiones en el cerebro que dirigen las decisiones obtenidas a partir del modelo. Este trabajo marca los primeros pasos de posibles nuevos modelos predictivos destinados a mejorar la gestión de pacientes con EM, sentando las bases para una potencial futura integración en la práctica clínica rutinaria.Multiple sclerosis (MS) is a chronic disease of the central nervous system characterised by inflammation, demyelination and neurodegeneration. MS is one of the main non-traumatic causes of irreversible disability in young adults, and its disease course is highly variable among individuals. In the clinical routine, magnetic resonance imaging (MRI) is an essential tool to help with the diagnosis and prognosis of MS. The combination of deep learning-based models with MRI has presented promising results in this field. However, the underlying predictive features of MS progression remain a subject of ongoing research. In this PhD Thesis, we question whether deep learning models solely applied to structural brain MRI scans can be used to predict different disease course status of patients with MS and their potential applicability in clinical practice. To achieve this goal, we present two approaches for stratifying MS patients in cross-sectional studies and one prognostic study. For each proposal we include interpretability strategies to make the deep learning models more explainable and trustworthy to clinicians. An in-house cohort of MS patients prospectively followed over time after their first demyelinating attack has been the unifying thread of this PhD Thesis. In the first study, we proposed a deep learning approach to perform a binary stratification of patients with MS based on their disability score assessed by a neurologist, building a model that only takes as input the whole brain MRI at a single time-point. Assessing the interpretability of the results obtained through attention maps, we observed the importance of the frontotemporal cortex and the cerebellum for the development of disability accumulation. In the subsequent study, we analysed the use of the same deep learning approach applied to different predefined regional inputs to compare them with the whole brain approach. These regions included white matter and grey matter tissues, lateral ventricles, brain stem and cerebellum structures, and subcortical grey matter structures. Even though the grey matter regional model performed the best, when evaluating the model in an external validation dataset, the results suggested that the global approach offered the best and most robust performance for generalisation. Finally, we proposed a discrete-time survival model to predict the survival function of patients with a first demyelinating attack who will develop a first event of progression independent of relapse activity (PIRA), only using a brain MRI scan acquired at symptom onset as input. With the obtained results, we were able to improve the predictive power of a classical survival model built with the strongest PIRA predictor, the age at the first attack. Furthermore, we extracted attention maps that revealed the frontoparietal cortex as the most important anatomical region for the decisions made by the deep learning survival model. In this PhD Thesis, we have successfully developed precise and automated deep learning models supported by explainability algorithms trying to reveal the focuses leading the output decisions. This work marks the initial steps of potential new predictive models aimed to improve the management of patients with MS, paving the path toward potential integration into routine clinical practice in the future

Estratègies d'optimització del tractament de la malaltia de Chagas

Els tractaments actuals amb benznidazol (BNZ) per la fase crònica de la malaltia de Chagas (MC) presenten nombrosos inconvenients, ja que s'associen a taxes de curació baixes i a l'aparició de toxicitat en més del 50% dels individus, especialment en forma de reacció cutània. Anteriorment, aquestes reaccions s'han relacionat amb la presència de l'al·lel HLA-B*35:05. L'objectiu d'aquesta tesi és optimitzar el tractament actual seguint dues estratègies: per una banda descriure els factors de risc per presentar reaccions cutànies d'hipersensibilitat i confirmar de forma prospectiva la seva associació amb l'al·lel HLA-B*35:05; i per altra banda comparar l'eficàcia parasitològica i la seguretat del BNZ en 3 esquemes terapèutics diferents. El primer estudi és un estudi observacional prospectiu que inclou individus en la fase crònica de la MC que acceptaven rebre tractament amb BNZ seguint les guies actuals. Es va genotipar l'al·lel HLA-B a tots els participants. Es va fer seguiment clínic i analític els dies 0, 7, 14, 30 i 60 del tractament. Es van incloure 207 participants. Un 70% eren dones amb una edat mitjana de 45.1 (SD ±9.86) anys, majoritàriament de Bolívia (92.8%). En 102 (49.3%) dels casos es va diagnosticar una reacció cutània. D'aquestes, 48 (46.6%) es van classificar com a lleus, 37 (35.9%) com a moderades i 18 (17.5%) com a severes. Fins a 31 (15.4%) dels individus van haver d'interrompre el tractament de manera definitiva. El sexe femení (OR 4.49 [IC95% 1.62-12.47]), la eosinofília de nova aparició (OR 2.55 [IC95% 1.2-5.43]) i ser portador del grup al·lèlic HLA-B*35 (OR 2.58 [IC95% 1.2-5.51]) eren predictors de reaccions cutànies moderades o severes. El segon treball és l'assaig clínic MULTIBENZ, un assaig clínic fase 2b, aleatoritzat, doble-cec que es va dur a terme a l'Argentina, el Brasil, Colòmbia i Espanya. Vam incloure individus adults diagnosticats de MC amb DNA de T. cruzi detectable per qPCR en sang perifèrica. Els participants van ser aleatoritzats utilitzant un esquema d'aleatorització balancejat per blocs i estratificat per país en una proporció de 1:1:1 a rebre 3 esquemes diferents: 300mg/60dies (control treatment; CT), 150mg/60dies (low-dose treatment; LDT), o 400mg/15dies (short treatment; ST). L'objectiu primari era la proporció de participants amb una negativització parasitològica sostinguda mesurada mitjançant qPCR durant el període de 12 mesos de seguiment. L'objectiu primari de seguretat era la proporció d'individus que havien de suspendre el tractament de forma definitiva. Ambdós anàlisis es van basar en la població per intenció-de-tractar. Des de l'Abril de 2017 al Setembre de 2020 es van incloure un total de 245 pacients i després de les exclusions, 234 participants van ser aleatoritzats i inclosos a l'anàlisi: 78, 77 i 79 participants al grup CT, LDT i ST respectivament. Es va observar una negativització parasitològica sostinguda en 42/78 (54%) individus al grup CT, 47/77 (61%) al grup LDT i 46/79 (58%) al grup ST amb una OR de 1.41 [IC95% 0·69-2·88] quan comparàvem el grup LDT amb el CT i una OR 1.23 [0.61-2.50] quan comparàvem el grup ST vs. CT. Un total de 177 (76%) dels participants van reportar algun efecte advers: 62 (79%) del grup CT, 56 (73%) del LDT i 59 (77%) del grup ST. No obstant, les suspensions foren menys freqüents en el grup ST comparat amb el grup CT (2% vs. 14%, OR 0.20 [95% CI 0.04-0.95]). D'aquests resultats concloem que els individus portadors del grup al·lèlic HLA-B*35 presenten un major risc de reaccions cutànies moderades o greus sota tractament amb BNZ. A més a més, es conclou també que els 3 règims terapèutics presenten una resposta parasitològica similar, tot i que els nous podrien disminuir la proporció d'efectes adversos i per tant millorar-ne l'adherència.Los tratamientos actuales con benznidazol (BNZ) para la fase crónica de la enfermedad de Chagas (EC) presentan numerosos inconvenientes, ya que se asocian a tasas de curación bajas y a la aparición de toxicidad en más del 50% de los individuos, especialmente en forma de reacción cutánea. Anteriormente, estas reacciones se relacionaron con la presencia del alelo HLA-B*35:05. El objetivo de esta tesis es el de optimizar el tratamiento actual siguiendo dos estrategias: describir los factores de riesgo para presentar reacciones cutáneas de hipersensibilidad y confirmar de forma prospectiva su asociación con el alelo HLA-B*35:05; así como comparar la eficacia parasitológica y la seguridad del BNZ en 3 esquemas terapéuticos diferentes. El primer estudio es un estudio observacional prospectivo que incluye individuos en la fase crónica de la EC que aceptaron recibir tratamiento con BNZ siguiendo las guías actuales. Se genotipo el alelo HLA-B a todos los participantes. Se hizo seguimiento clínico y analítico los días 0, 7, 14, 30 y 60 del tratamiento. Se incluyeron 207 participantes. Un 70% eran mujeres con una edad media de 45.1 (SD ±9.86) años, mayoritariamente de Bolivia (92.8%). En 102 (49.3%) de los casos se diagnosticó una reacción cutánea. De éstas, 48 (46.6%) se clasificaron como leves, 37 (35.9%) como moderadas y 18 (17.5%) como severas. En 31 (15.4%) de los individuos se tuvo que interrumpir el tratamiento definitivamente. El sexo femenino (OR 4.49 [IC95% 1.62-12.47]), la eosinofilia de nueva aparición (OR 2.55 [IC95% 1.2-5.43]) y ser portador del grupo alélico HLA-B*35 (OR 2.58 [IC95% 1.2-5.51]) eran predictores de reacciones cutáneas moderadas o severas. El segundo trabajo es el ensayo clínico MULTIBENZ, un ensayo clínico fase 2b, aleatorizado, doble ciego que se llevó a cabo en Argentina, Brasil, Colombia y España. Se incluyeron individuos adultos diagnosticados de EC con DNA de T. cruzi detectable por qPCR en sangre periférica. Los participantes fueron aleatorizados utilizando un esquema de aleatorización balanceado por bloques y estratificado por país en una proporción 1:1:1 a recibir 3 esquemas diferentes: 300mg/60 días (control treatment; CT), 150mg/60días (low-dose treatment; LDT), o 400mg/15días (short treatment; ST). El objetivo primario era la proporción de participantes con una negativización parasitológica sostenida medida mediante qPCR durante el periodo de 12 meses de seguimiento. El objetivo primario de seguridad era la proporción de individuos que tenían que suspender el tratamiento de forma definitiva. Ambos análisis se basaron en la población por intención-de-tratar. Desde abril de 2017 a septiembre de 2020 se incluyeron un total de 245 participantes y después de las exclusiones, 234 fueron aleatorizados e incluidos en el análisis: 78, 77 i 79 participantes en el grupo CT, LDT i ST respectivamente. Se observó una negativización parasitológica sostenida en 42/78 (54%) individuos en el grupo CT, 47/77 (61%) en el grupo LDT y 46/79 (58%) en el grupo ST con una OR de 1.41 [IC95% 0·69-2·88] cuando comparábamos el grupo LDT con el CT y una OR 1.23 [0.61-2.50] cuando comparábamos el grupo ST vs. CT. Un total de 177 (76%) de los participantes reportaron algún efecto adverso: 62 (79%) del grupo CT, 56 (73%) del LDT y 59 (77%) del grupo ST. No obstante, las suspensiones fueron menos frecuentes en el grupo ST comparado con el grupo CT (2% vs. 14%, OR 0.20 [95% CI 0.04-0.95]). De estos resultados concluimos que los individuos portadores del grupo alélico HLA-B*35 presentan un mayor riesgo de reacciones cutáneas moderadas o graves con el tratamiento con BNZ. Además, concluimos que los 3 regímenes terapéuticos presentan una respuesta parasitológica similar, aunque los nuevos esquemas podrían disminuir la proporción de efectos adversos y por lo tanto mejorar la adherencia.Current treatment with benznidazole (BNZ) for chronic Chagas disease (CD) is far from ideal, as it is associated with low cure rates and substantial toxicity in more than 50% of individuals, especially cutaneous events, leading to discontinuation in approximately 15%. These reactions have been previously related to the specific allele HLA-B*35:05. The objective of the present thesis is to optimize the actual treatment following two strategies: to describe risk factors for cutaneous toxicity and prospectively confirm the association with the allele HLA-B*35:05; and to compare the parasitological efficacy and safety of 3 different benznidazole regimens. The first study is a prospective observational study including adult chronic CD individuals who accepted to receive benznidazole treatment following current guidelines. Allele genotyping of HLA-B was determined in all participants. Clinical and analytical follow-up was performed at days 0, 7, 14, 30 and 60 of treatment. Two-hundred and seven individuals were included. Seventy percent were female with a mean age of 45.1 (SD ±9.86) years mainly from Bolivia (92.8%). In 102 (49.3%) cases a cutaneous reaction was diagnosed. Forty-eight (46.6%) were classified as mild, 37 (35.9%) as moderate and 18 (17.5%) as severe. Thirty-two (15.4%) subjects had to definitively interrupt the treatment due to a cutaneous reaction. Female sex (OR 4.49; 95%CI 1.62-12.47), new-onset eosinophilia prior to cutaneous symptoms (OR 2.55; 95%CI 1.2-5.43) and carrying the HLA-B*35 allelic group (OR 2.58; 95%CI 1.2-5.51) were all predictors of moderate to severe cutaneous reactions. The second study is the MULTIBENZ trial. A 2b phase, randomized, double-blind, clinical trial performed in Argentina, Brazil, Colombia, and Spain. We included participants aged 18 years and above diagnosed with CD and a detectable T. cruzi DNA by qPCR in blood. Participants were randomized using a balanced block randomization scheme stratified by country, in a 1:1:1 proportion to receive BNZ at 3 different doses: 300mg/60days (control treatment; CT), 150mg/60days (low-dose treatment; LDT), or 400mg/15days (short treatment; ST). The primary objective was the proportion of patients with a sustained parasitological negativity by means of qPCR during a follow-up period of 12 months. The primary safety outcome was the proportion of people who permanently discontinued the treatment. Both primary efficacy analysis and primary safety analysis were based in the intention to-treat population. From April 2017 to Sept 2020 the trial enrolled 245 people and after exclusions, 234 randomized patients were included in the analysis: 78, 77 and 79 participants in the CT, LDT and ST groups respectively. Sustained parasitological negativity was observed in 42/78 (54%) individuals in the CT group, 47/77 (61%) in the LDT set and 46/79 (58%) in the ST group with an OR 1.41 [95% CI 0·69-2·88] when comparing the LDT with the CT, and an OR 1.23 [0.61-2.50]) comparing the ST vs. CT. One-hundred seventy-seven (76%) participants reported an adverse event (AE): 62 (79%) among CT, 56 (73%) in LDT and 59 (77%) in the ST set. However, discontinuations were less frequent in the ST arm compared to the CT arm (2% vs. 14% OR 0.20 [95% CI 0.04-0.95]). As a conclusion, individuals carrying the HLA-B*35 allelic group are at higher risk of moderate to severe reactions when taking benznidazole treatment. Furthermore, participants in the three therapeutic regimens had a similar parasitological response. However, new regimens may decrease AE and enhance treatment adherence

High-Efficiency Multiuser Wireless Power Transfer by Sequentially Tracking the Optimal Rectified Power of Multiple Groups With a Power-Limited Transmitter

In a practical wireless power transfer (WPT) system with multiple nonlinear receivers and a power-limited transmitter, rectification efficiency may be low because the received radio frequency (RF) power of the receiver does not match the optimal rectified power. To tackle the challenge that a power-limited transmitter actively transmits RF power to satisfy different power demands with high efficiency and large average output direct current (dc) power, this article proposes a novel high-efficiency multiuser WPT. In this scheme, the transmission signals are optimized based on the received RF signals with power equal to the optimal rectified power from the selected receivers, so the selected receivers can track the optimal rectified power within a time slot. Then, we formulate a bilevel optimization problem under the constraint of transmit power to group all receivers and optimize the transmission signals of each group. Multiple groups sequentially track the optimal rectified power across multiple time slots with a power-limited transmitter, thereby tackling the challenge. In order to solve the nonconvex bilevel optimization problem, a bilevel genetic algorithm is adopted to obtain the optimal solution. Numerical and experimental results show that the RF-RF-dc efficiency and output dc power of the proposed scheme are up to 2.6 and 3.7 times higher than those of the traditional schemes. Additionally, only our scheme meets the different power demands of multiple receivers, ensuring the same survival time. Furthermore, our scheme can also provide guidance for practical WPT system design and has the potential of compatibility with other existing systems

Highly Sensitive Coplanar Waveguide (CPW) reflective-mode phase-variation permittivity sensors based on weakly coupled Step-Impedance Resonators (SIRs)

This article presents a small-sized and highly sensitive planar microwave permittivity sensor based on a pair of weakly coupled step-impedance resonators (SIRs), the sensing elements. The sensor, a one-port structure, is implemented in coplanar waveguide (CPW) technology, and it operates in the reflection mode. The sensing principle is the variation in the phase of the reflection coefficient at the operating frequency, the output variable, caused by the changes in the dielectric constant of the material under test (MUT). This article demonstrates that the maximum sensitivity is inversely proportional to the square of the electric coupling coefficient between the sensing SIRs. Thus, the sensitivity can be unprecedentedly enhanced by merely separating enough the coupled SIRs (thereby reducing their mutual coupling). Since the sensing area is circumscribed to the region occupied by the square (capacitive) patches of the SIRs, it follows that the proposed sensor exhibits also a very high figure of merit ( FoM=26551∘/λ2 ), or ratio between the maximum sensitivity and the size of the sensing area expressed in terms of the squared guided wavelength, λ2

Alcohol Advertising : Unveiling the Associations between Hegemonic Masculinity Traits, Advertising Message Strategies, and Types of Alcoholic Beverages

A nivel mundial, la publicidad y el consumo de alcohol se han asociado con la salud y las condiciones de riesgo, especialmente en los hombres. Los estudios demuestran que los anunciantes de alcohol emplean rasgos de masculinidad hegemónica (RMH-HMT) en sus estrategias de mensajes publicitarios. Sin embargo, los estudios no logran identificar la asociación entre esos rasgos, las estrategias de mensajes publicitarios y el tipo de alcohol que se anuncia. Esta tesis (desarrollada a través de tres artículos) presenta un marco conceptual y nuevas perspectivas sobre la aplicabilidad de la Teoría de la Masculinidad Hegemónica de Connell y la Rueda de Estrategias de Mensaje de Seis Segmentos de Taylor a los anuncios de alcohol de una sociedad patriarcal no occidental. Se investiga la prevalencia de los RMH, su asociación con el tipo de alcohol, los niveles de exposición, las diferencias entre los niveles de exposición, las estrategias de mensaje más prevalentes, la asociación entre las estrategias de mensaje y el tipo de alcohol, y la asociación entre las estrategias de mensaje y los RMH en 182 anuncios de cerveza y bebidas alcohólicas destiladas fabricadas en Ghana. En promedio, los spots mostraron un alto nivel de masculinidad hegemónica. Los hallazgos revelaron que la camaradería es el rasgo masculino hegemónico más prevalente, con una asociación significativa de la camaradería con los anuncios de cerveza y la sexualidad con los anuncios de bebidas alcohólicas destiladas. Los anuncios utilizaron más la estrategia ritual (apelación emocional) de la rueda de estrategias de mensajes de Taylor que la estrategia de transmisión (apelación racional). La primera se asoció significativamente con rasgos de camaradería y responsabilidad. El segmento de necesidad aguda, que se dirige a las necesidades inmediatas de los consumidores, se asoció con los anuncios de cerveza, mientras que el segmento de la razón que proyecta la propuesta de venta única de los productos se asoció con los anuncios de bebidas alcohólicas destiladas (estrategias de transmisión). Finalmente, el estudio describe limitaciones y propone recomendaciones para futuras investigaciones.A escala global, la publicitat i el consum d'alcohol s'han associat amb problemes de salut i risc, especialment entre els homes. Els estudis mostren que els anunciants d'alcohol utilitzen trets masculins hegemònics (TMH-HMT) en les seves estratègies de missatges publicitaris. No obstant això, aquests estudis no identifiquen l'associació entre els TMH, les estratègies de missatges publicitaris i el tipus d'alcohol que es publicita. Aquesta tesi (presentada a través de tres articles) presenta un marc conceptual i noves perspectives sobre l'aplicació als anuncis d'alcohol d'una societat patriarcal no occidental tant de la teoria de la masculinitat hegemònica de Connell com de la roda de l'estratègia de missatges de sis segments de Taylor. Investiga, en 182 anuncis de cervesa i beguda destillades alcohòliques fabricades a Ghana, la prevalença dels TMH, la seva associació amb el tipus d'alcohol, els nivells d'exposició, les diferències entre els nivells d'exposició, les estratègies de missatges més habituals, l'associació entre les estratègies de missatges i el tipus d'alcohol, i l'associació entre les estratègies de missatges i els TMH. De mitjana, els anuncis van presentar un alt nivell de masculinitat hegemònica. Les troballes van revelar que la camaraderia era el tret masculí hegemònic més prevalent, amb una associació significativa de la camaraderia amb els anuncis de cervesa i de la sexualitat amb les begudes destil·lades alcohòliques. Els anuncis d'alcohol ghanesos van utilitzar més l'estratègia ritual (apel·lació emocional) de la roda d'estratègia de missatges de Taylor que l'estratègia de transmissió (apel·lació racional). La primera es va associar significativament amb trets de camaraderia i responsabilitat. El segment de necessitat aguda, que s'adreça a les necessitats immediates dels consumidors, es va associar als anuncis de cervesa, mentre que el segment de la raó que projecta la proposta de venda única dels productes, es va associar amb les begudes destil·lades alcohòliques (estratègies de transmissió). Finalment, l'estudi adreça les limitacions i ofereix recomanacions per a futures investigacions.Globally, alcohol advertising and consumption have been associated with health and risk conditions especially among men. Studies show that alcohol advertisers employ hegemonic masculine traits (HMTs) in their advertising message strategies. However, the studies fail to identify the association between the HMTs, advertising message strategies, and the type of alcohol being advertised. This thesis (presented as three articles) presents a framework and novel insights on the applicability of Connell's Hegemonic Masculine Theory and Taylor's Six Segment Message Strategy Wheel to alcohol ads from a non-Western patriarchal society. It investigates the prevalence of HMTs, their association with the type of alcohol, exposure levels, differences between exposure levels, most prevalent message strategies, the association between message strategies and alcoholic type, and the association between message strategies and HMTs in 182 Ghanaian-manufactured beer and bitters ads. On average, the commercials portrayed a high level of hegemonic masculinity. The findings revealed bonding as the most prevalent hegemonic masculine trait, with a significant association of bonding with beer ads, and sexuality with bitters ads. Ghanaian alcohol ads used more of the ritual strategy (emotional appeal) of Taylor's message strategy wheel than the transmission strategy (rational appeal). The former was significantly associated with bonding and responsibility traits. The acute need segment, which targets consumers immediate needs, associated with beer ads, while the ration segment which projects the products unique selling proposition, was associated with bitters ads (transmission strategies). Finally, the study highlights limitations and recommendations for future research.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Comunicació Estratègica, Publicitat i Relacions Públique

maría carmen garcía- nieto : historiadora social, humanista i feminista

Resum María Carmen García-Nieto París (1929-1997), va participar en la renovació de la historiografia d'Espanya cap a una historia social, donant protagonisme a aquelles persones que no havien tingut un lloc en la historia del nostre país. Les investigacions d'aquesta historiadora catalana van estar orientades a rescatar la contribució i el treball de les dones durant la II Republicà, la Guerra Civil i el franquisme, identificant els valors i l'activisme polític femení. Va ser la fundadora del Col·lectiu 36, des del qual, a partir de les fonts orals, va donar visibilitat a les dones de la Guerra Civil. García-Nieto va donar veu a les dones immigrant en el seu llibre " La palabra de las mujeres" a partir de la seva experiència a l'Escola d'adults del barri obrer de Palomeras a Madrid. La seva trajectòria vital i professional va acabar a la Fundació Utopia de Cornellà, entrevistant a dones obreres del Baix Llobregat. L'objectiu es valorar la contribució de la historiadora en el feminisme del nostre país a traves de la creació de l'Institut de Investigacions Feministes en la UCM, des d'on es va promocionar la investigació i l'estudi del feminisme a Espanya. Paraules claus: Nova historiografia, Fonts Orals, Investigacions Feministes, Compromis social i Utopia.RESUMEN María Carmen García-Nieto Paris (1929-1997), participó en la renovación de la historiografía de España hacia una historia social, dando protagonismo a aquellas personas que no habían tenido su lugar en la historia de nuestro país. Las investigaciones de esta historiadora catalana estuvieron orientadas a rescatar la contribución y el trabajo de las mujeres durante la II República, la Guerra Civil y el Franquismo, identificando los valores y el activismo político femenino. Fue la fundadora del Colectivo 36, desde el cual, a partir de las fuentes orales, dio visibilidad a las mujeres de la Guerra Civil. García-Nieto dio voz a las mujeres inmigrantes en su libro "La palabra de las Mujeres" a partir de su experiencia en la Escuela de Adultos del barrio obrero de Los Palomares de Madrid. Su trayectoria vital y profesional acabó en La Fundación Utopía de Cornellá, entrevistando a mujeres obreras del Baix Llobregat. El objetivo es valorar la contribución de la historiadora en el feminismo de nuestro país a través de la creación del Instituto de Investigaciones Femeninas en la UCM, desde donde se promocionó la investigación y el estudio del feminismo en España. Palabras claves: Historiografía nueva, Fuentes Orales, Investigaciones Femeninas, Compromiso social y Utopía.ABSTRACT María Carmen García-Nieto Paris (1929-1997), participated in the renovation of the historiography of Spain towards a social history, giving prominence to those people who had not had their place in the history of our country. The investigations of this Catalan historian were aimed at rescuing the contribution and work of women during the Second Republic, the Civil War and the Franco regime, identifying the values and female political activism. Was the founder of Colectivo 36, from which, based on oral sources, she gave visibility to the women of the Civil War. García-Nieto gave immigrant women a voice in her book "La palabra de las Mujeres" based on her experience at the School for Adults in the working-class neighborhood of Los Palomares in Madrid. Her life and professional career ended at the Fundación Utopía in Cornellá, interviewing working women from Baix Llobregat. The objective is to assess the contribution of the historian to feminism in our country through the creation of the Institute for Women's Research at the UCM, where the research and study of feminism in Spain was promoted. Keywords: New Historiography, Oral Sources, Feminine Research, Social Commitment and Utopia.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Estudis de Gènere: Cultures, Societats i Polítique

Los conflictos transnacionales de América Latina en la prensa china (1879-1935) : la construcción de la mirada exterior de la élite china en una realidad periférica

Durant la segona meitat del segle XIX i la primera meitat del XX, Amèrica Llatina va experimentar diversos conflictes transnacionals a causa de la manca de delimitació fronterera a l¿època colonial i la intervenció de les potències occidentals. Alhora, la Xina va esdevenir una semicolònia sota «el sistema dels tractats» imposat per les potències. En aquest context, fundada i inspirada pels missioners estrangers i impulsada pels «reformistes» vernacles, la premsa moderna va sorgir a la Xina. Aquesta, des de l¿inici, va informar sobre els conflictes i va presentar els països bel·ligerants als lectors xinesos, forjant els coneixements de l¿elit sobre l¿Amèrica Llatina, i fins i tot sobre el món exterior. Considerant aquest escenari global, aquesta tesi analitza les representacions socials instituïdes per la premsa de la Xina sobre quatre conflictes transnacionals ocorreguts a Amèrica Llatina entre 1879 i 1935: la Guerra del Pacífic (1879-1883), la Guerra Hispanoamericana (1898), el Conflicte de Tacna i Arica (1883-1929) i la Guerra del Chaco (1932-1935). El factor comú de les quatre disputes va ser la influència o participació de les potències occidentals. La metodologia de la tesi és interdisciplinària. Des d¿una perspectiva històrica per comprendre les connexions entre els conflictes llatinoamericans i la Xina, fem servir la teoria de les representacions socials, l¿estudi del discurs i la traducció. D¿aquesta manera, duem a terme l¿anàlisi tant qualitativa com quantitativa de les 2710 notícies publicades a 116 periòdics, les quals són complementades per la documentació de primera mà guardada als arxius de la Xina. Basada en un estudi diacrònic, la investigació demostra una història compartida entre la Xina i l¿Amèrica Llatina, mentre aclareix la comprensió de l¿elit xinesa sobre la regió i el canvi de les seves dinàmiques polítiques, econòmiques i culturals. Com a resultat, la tesi sosté que els periòdics publicats a la Xina van instituir un conjunt de representacions socials sobre els esdeveniments abans esmentats. Aquest procés creatiu es va desenvolupar en dues fases. A la primera, la mirada xinesa va estar intervinguda pels periodistes anglòfons assentats al país, que van esdevenir una elit estrangera que, amb suport de la mà d¿obra local, va controlar la informació i va difondre la seva cosmovisió, definint el marc per pensar en els Estats partícips a la conjuntura bèl·lica. A la segona, després dels moviments antiimperialistes xinesos dels anys vint, les dinàmiques de la relació entre els conflictes llatinoamericans i la premsa xinesa van experimentar transformacions notables. Els intel·lectuals nacionalistes xinesos van començar a dominar l¿opinió sobre els esdeveniments de la regió. Aquest canvi indica que la comprensió de l¿elit xinesa sobre l¿Amèrica Llatina va començar a evolucionar cap a una independència gradual.Durante la segunda mitad del siglo XIX y la primera mitad del XX, América Latina experimentó varios conflictos transnacionales debido a la falta de delimitación fronteriza en la época colonial y la intervención de las potencias occidentales. Al mismo tiempo, China devino una semicolonia bajo «el sistema de los tratados» impuesto por las potencias. En este contexto, fundada e inspirada por los misioneros extranjeros e impulsada por los «reformistas» vernáculos, la prensa moderna surgió en China. Ésta, desde el inicio, informó sobre los conflictos y presentó los países beligerantes a los lectores chinos, forjando los conocimientos de la élite sobre América Latina, e incluso sobre el mundo exterior. Considerando ese escenario global, la presente tesis analiza las representaciones sociales instituidas por la prensa de China sobre cuatro conflictos transnacionales ocurridos en América Latina entre 1879 y 1935: la Guerra del Pacífico (1879-1883), la Guerra Hispanoamericana (1898), el Conflicto de Tacna y Arica (1883-1929) y la Guerra del Chaco (1932-1935). El factor común de las cuatro disputas fue la influencia o participación de las potencias occidentales. La metodología de la tesis es interdisciplinaria. Desde una perspectiva histórica para comprender las conexiones entre los conflictos latinoamericanos y China, utilizamos la teoría de las representaciones sociales, el estudio del discurso y la traducción. De esta manera, llevamos a cabo el análisis tanto cualitativo como cuantitativo de las 2710 noticias publicadas en 116 periódicos, las cuales son complementadas por la documentación de primera mano guardada en los archivos de China. Basada en un estudio diacrónico, la investigación demuestra una historia compartida entre China y América Latina, mientras aclara la comprensión de la élite china sobre la región y sobre el cambio de sus dinámicas políticas, económicas y culturales. Como resultado, la tesis sostiene que los periódicos publicados en China instituyeron un conjunto de representaciones sociales sobre los acontecimientos antes mencionados. Este proceso creativo se desenvolvió en dos fases. En la primera, la mirada china estuvo mediada por los periodistas anglófonos asentados en el país, quienes devinieron en una élite extranjera que, con apoyo de la mano de obra local, controló la información y difundió su cosmovisión, definiendo el marco para pensar en los Estados partícipes en la coyuntura bélica. En la segunda, después de los movimientos antiimperialistas chinos de los años veinte, las dinámicas de la relación entre los conflictos latinoamericanos y la prensa china experimentaron transformaciones notables. Los intelectuales nacionalistas chinos empezaron a dominar la opinión sobre los acontecimientos de la región. Este cambio indica que la comprensión de la élite china sobre América Latina comenzó a evolucionar hacia una independencia gradual.During the second half of the 19th century and the first half of the 20th, Latin America experienced several transnational conflicts due to the lack of border delimitation in the colonial era and the intervention of Western powers. At the same time, China became a semi-colony under "the treaty system" imposed by the powers. In this context, founded and inspired by foreign missionaries and promoted by vernacular "reformists", the modern press emerged in China. This, from the beginning, reported on the conflicts and presented the belligerent countries to Chinese readers, forging the elite's knowledge about Latin America, and even about the outside world. Considering this global scenario, this thesis analyzes the social representations instituted by the Chinese press about four transnational conflicts that occurred in Latin America between 1879 and 1935: the Pacific War (1879-1883), the Spanish-American War (1898), the Conflict of Tacna and Arica (1883-1929) and the Chaco War (1932-1935). The common factor of all four disputes was the influence or involvement of Western powers. The methodology of the thesis is interdisciplinary. From a historical perspective to understand the connections between Latin American conflicts and China, we use the theory of social representations, the study of discourse and translation. In this way, we carry out both qualitative and quantitative analysis of the 2710 news items published in 116 newspapers, which are complemented by first-hand documentation stored in the archives of China. Based on a diachronic study, the research demonstrates a shared history between China and Latin America, while clarifying the Chinese elite's understanding of the region and its changing political, economic and cultural dynamics. As a result, the thesis maintains that the newspapers published in China instituted a set of social representations about the aforementioned events. This creative process took place in two phases. In the first, the Chinese gaze was mediated by Anglophone journalists settled in the country, who became a foreign elite that, with the support of the local workforce, controlled the information and disseminated their worldview, defining the framework for thinking about the States participating in those conflicts. In the second, after the Chinese anti-imperialist movements of the 1920s, the dynamics of the relationship between Latin American conflicts and the Chinese newspapers underwent notable transformations. Chinese nationalist intellectuals began to dominate opinion on events in the region. This shift indicates that the Chinese elite's understanding of Latin America began to evolve toward gradual independence