Artificial Intelligence applications in veterinary ophthalmology

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, área científica de ClínicaArtificial Intelligence (AI) is becoming increasingly integrated into everyday life and both human and animal medicine. However, its accuracy, benefits, and real-life use in veterinary ophthalmology require substantial research. To address this gap, this experimental study aims to evaluate the accuracy of two AI applications in veterinary ophthalmology: one based on natural language processing (NLP) and the other using a Convolutional Neural Network (CNN) approach. The performance of GPT-3.5 and GPT-4o, large language models (LLM) based on NLP, was evaluated in the veterinary ophthalmology field using a set of 53 multiple-choice questions with an ophthalmological base. GPT-3.5 and GPT-4o were tested over time for the same questions, and both English and Portuguese languages were used. A follow-up question was made to observe the model answer’s consistency. Results showed that GPT-4o outperformed GPT-3.5 in both languages, and both models improved their answers over time. GPT-4o achieved 81.1% and 66% maximum accuracy and GPT-3.5 reached 47.2 and 50.9% in English and Portuguese, respectively. Results after the follow-up question showed a higher percentage of "No change" responses in GPT-4o but both versions tend to shift correct answers to incorrect ones. Despite some limitations, this powerful AI tool can provide supplementary educational material or assist in clinical decision-making. Furthermore, the accuracy of an open-access AI application, Equine A-Eye, was also assessed. This application, available for smartphones, uses a CNN approach for image classification and aims to help detect signs of ocular disease in equines, specifically uveitis. To evaluate the application’s accuracy, 22 horses were used. After a complete ophthalmological exam performed by two trained veterinary ophthalmologists, a diagnosis was obtained and digital photographs of both eyes were taken for later evaluation by the application. A set of 76 eye images was obtained and classified by the application. The results were compared with the previous clinical diagnosis. Only 13 out of 76 images (17.1%) were classified identically by the clinicians and the AI app. The poor result of this image classification and details regarding the application itself highlights the need for more reliable and effective AI tools specifically developed for veterinary ophthalmology, ultimately improving the quality of care in veterinary medicine. These tools exemplify AI’s power in veterinary ophthalmology. Nonetheless, advanced research, refined approaches, and improved methods are needed to drive meaningful progress in this fieldRESUMO - Aplicações de Inteligência Artificial em Oftalmologia Veterinária - A Inteligência Artificial (IA) está cada vez mais integrada na vida quotidiana e na medicina humana e animal. No entanto, a sua eficácia, benefícios e aplicação na prática clínica no campo da oftalmologia veterinária carece de investigação substancial. De forma a colmatar esta lacuna, este estudo experimental tem como objetivo avaliar a precisão de duas aplicações de inteligência artificial na oftalmologia veterinária: uma baseada em processamento de linguagem natural (NLP) e outra que utiliza redes neurais convolucionais (CNNs) para classificação de imagens. O desempenho dos modelos GPT-3.5 e GPT-4o, que são modelos linguísticos de grande dimensão baseados NLP, foi avaliado no domínio da oftalmologia veterinária através das suas respostas a um conjunto de 53 perguntas de escolha múltipla com base oftalmológica. Os modelos foram testados ao longo do tempo, e avaliados em inglês e português. Além disso, foi realizada uma questão de “follow-up” para observar a consistência das respostas dadas. Os resultados demonstraram que o GPT-4o superou o GPT-3.5 em ambas as línguas, atingindo uma precisão máxima de 81,1% em inglês e 66% em português, enquanto o GPT-3.5 obteve 47,2% e 50,9%, respetivamente. Ambos os modelos aprimoraram suas respostas ao longo do tempo, mas apresentaram uma tendência para modificar respostas corretas para incorretas após a questão de “follow-up”. Apesar de algumas limitações, esta poderosa ferramenta de IA pode fornecer material educacional complementar ou auxiliar na tomada de decisões clínicas na área de oftalmologia veterinária. A segunda aplicação de IA analisada baseia-se em CNNs para a classificação de imagens. A aplicação Equine A-Eye, de acesso livre e disponível para smartphones, tem como objetivo auxiliar na deteção de sinais de doença ocular, especificamente uveíte equina. Para avaliar a sua precisão, foram utilizados 22 equinos e um total de 76 imagens oculares foram classificadas pela aplicação. Os resultados foram comparados com o diagnóstico veterinário prévio obtido após um exame oftalmológico completo realizado por dois veterinários oftalmologistas treinados. Apenas 13 das 76 imagens (17,1%) foram classificadas de forma idêntica pelos clínicos e pela aplicação. O fraco desempenho na classificação, aliado a detalhes técnicos da própria aplicação, evidencia a necessidade de desenvolver ferramentas de IA mais confiáveis e eficazes para a oftalmologia veterinária. Estas ferramentas exemplificam o potencial da IA na oftalmologia veterinária. Contudo, são necessários mais estudos e melhores metodologias para garantir o desenvolvimento adequado desta tecnologia nesta áreaN/

Papel dos parâmetros inflamatórios do leucograma e das plaquetas na insuficiência cardíaca descompensada : estudo observacional retrospetivo

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023Introdução: A Insuficiência Cardíaca (IC) é uma síndrome inflamatória sistémica incurável. A inflamação tem um papel no desenvolvimento, progressão e complicações da IC, sendo causa e consequência desta. Alguns parâmetros inflamatórios podem ser potenciais biomarcadores de gravidade e prognóstico da IC. Objetivo: Investigar o valor prognóstico da contagem total e diferencial de leucócitos, plaquetas e rácios neutrófilos-linfócitos (RNL), monócitos-linfócitos (RML) e plaquetas-linfócitos (RPL) em doentes com IC. Métodos: Realizou-se um estudo observacional retrospetivo em indivíduos hospitalizados por IC descompensada classes III ou IV NYHA. Os índices inflamatórios estudados foram comparados com indicadores de gravidade definidos: NT-proBNP, FEj e mortalidade a 18 meses. A análise estatística foi realizada através do IBM SPSS Statistics 22. Resultados: Foram incluídos 65 indivíduos – 43,1% homens. A média de idades foi 79,25 (± 10.75) anos e a FEj 48,86% (± 18,21). A mortalidade a 18 meses foi 41,54%. O NT-proBNP apresentou correlação inversa com: FEj (coeficiente de correlação = - 0,479, p < 0,01); colesterol total (coeficiente de correlação = - 0,551, p < 0,01); HDL (coeficiente de correlação = - 0,589, p < 0,01); e IMC (coeficiente de correlação = - 0,483, p < 0,01). Num modelo de regressão linear múltipla, o NT-proBNP manteve associação inversa significativa com FEj (p = 0,011), HDL (p = 0,014) e IMC (p = 0,022). No qui-quadrado, a FEj relacionou-se com RNL (p = 0,018); e o edema agudo do pulmão com RNL (p = 0,024) e RPL (p = 0,023). As curvas de Kaplan-Meier foram significativas para leucócitos (p = 0,044) e IMC (p = 0,026). Conclusão: A leucopénia e o aumento dos rácios RNL e RPL, associados a um IMC baixo, poderão indicar um pior prognóstico nos indivíduos com IC descompensada de classes NYHA III e IV.Introduction: Heart failure (HF) in an incurable systemic inflammatory syndrome. Inflammation plays a role in the development, progression and complications of HF, being its cause and consequence. Some inflammatory parameters may be potential biomarkers of HF severity and prognosis. Objectives: To investigate the prognostic value of total and differential white blood cell count, platelets and neutrophil-lymphocyte (NLR), monocyte-lymphocyte (MLR) and platelet-lymphocyte (PLR) ratios in patients with HF. Methods: We conducted a retrospective observational study in individuals hospitalized for NYHA class III and IV decompensated HF. The inflammatory indices were compared with defined severity indicators: NT-proBNP, EF and 18-month mortality. Statistical analysis was performed using IBM SPSS Statistics 22. Results: 65 patients were included – 43,1% male. Mean age was 79,25 (± 10.75) years and EF 48.86% (± 18.21). 18-month mortality was 51,86%. NT-proBNP correlated inversely with: EF (correlation coefficient = - 0.479, p < 0.01); total cholesterol (correlation coefficient = - 0,551, p < 0,01); HDL (correlation coefficient = - 0,589, p < 0,01); and BMI (correlation coefficient = - 0,483, p < 0,01). In a multiple linear regression model, NT-proBNP maintained significant inverse association with EF (p = 0,011), HDL (p = 0,014) and BMI (p = 0,022). In the chi-square, EF was related to NLR (p = 0,018); and acute pulmonary edema with NLR (p = 0,024) and PLR (p = 0,023). Kaplan-Meier curves were significant for leukocytes (p = 0,044) and BMI (p = 0,026). Conclusion: Leukopenia and increased RNL and RPL ratios, associated with a low BMI, may indicate a worse prognosis in individuals with decompensated HF NYHA class III and IV

Design of packaging systems to improve shelf-life of higly perishable fresh fruits

Doutoramento em Engenharia Alimentar / Instituto Superior de Agronomia. Universidade de LisboaN/

Povoamento e fronteira na Serra de S. Mamede da Idade Média à Idade Moderna (Sécs. XIII – XV)

A principal questão de pesquisa desta dissertação para Doutoramento é a formação da rede urbana situada junto à Serra de S. Mamede, no Alto Alentejo, e os principais objetivos compreender como um sistema social se traduz em termos de localização e apropriação de espaço, focando a problemática numa região específica. Na delimitação espácio-temporal do campo de pesquisa, o âmbito cronológico definido é dos inícios do Séc. XIII aos finais do Séc. XV. O estudo inicia-se no momento em que a Serra de S. Mamede passa para a esfera de influência de controlo do reino de Portugal, quando Marvão era o principal eixo polarizador, culminando com a fase da realização do primeiro Numeramento do reino em 1527 e com a ascensão económica e política de Portalegre. A rede urbana em questão é composta pelas oito vilas principais que circundam a Serra de S. Mamede da parte do reino de Portugal: Portalegre, Marvão, Castelo de Vide, Arronches, Alegrete, Nisa, Alpalhão e Montalvão. A referida rede teve origem no processo de reconquista cristã, e criou-se a partir da necessidade de povoamento de uma zona quase erma que era preciso ocupar a fim de criar uma fronteira terrestre numa lógica ofensiva/defensiva para que aquele território, que representava uma barreira física estratégica, se mantivesse e desenvolvesse. A singularidade desta rede urbana está na sua localização física, porque a Serra de S. Mamede, que atinge a maior cota a sul do Tejo, representou a partir do século XIII uma barreira natural com o reino de Castela.The main research question of this PhD dissertation is the formation of the urban network located near the Serra de S. Mamede, in Alto Alentejo, and the main objectives are to understand how a social system translates in terms of location and appropriation of space, focusing on problematic in a specific region. In the spatio-temporal delimitation of the research field, the chronological scope defined is from the beginning of the 13th century to the end of the 15th century. The study begins when the Serra de S. Mamede goes to the political sphere of influence and control of the kingdom of Portugal, when Marvão was the main polarizing axis, culminating in the phase of the realization of the first Numeramento of the kingdom in 1527 and the economic and political rise of Portalegre begins. The urban network in question is made up of the eight main towns that surround the Serra de S. Mamede in the kingdom of Portugal: Portalegre, Marvão, Castelo de Vide, Arronches, Alegrete, Nisa, Alpalhão and Montalvão. This network was originated in the process of Christian reconquest, and was created from the need to populate an almost desert area that needed to be occupied in order to create a land border in an offensive/defensive logic for that territory, which represented a strategic physical barrier, maintained and developed in the kingdom of Portugal. The originality of this urban network lies in its physical location, because the Serra de S. Mamede, which reaches its highest elevation south of the Tagus, from the 13th century onwards also represented a natural barrier with the kingdom of Castile

Regulation of adenosine levels as a new therapeutic strategy for Rett Syndrome

Rett Syndrome (RTT) is a rare, genetically caused neurodevelopmental disorder that affects approximately 1:10000-15000 girls worldwide. It is characterized by an apparently normal development up to 6 to 18 months of age, followed by a regression phase, in which there is a loss of acquired abilities. During the progression of this disease, which takes place over four distinct stages, the following stand out: appearance of stereotyped and repetitive hand movements with progressive loss of functionality, cognitive and motor dysfunction and epilepsy. Currently, this disease has no cure and there are few therapeutic options for symptomatic control, which makes this disease devastating for both patients and caregivers. Genetic studies carried out in recent years have established that this syndrome is mainly due to mutations in the methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) gene, located on the X chromosome. This gene encodes the MeCP2 protein, which performs multiple functions where its role stands out as an epigenetic modulator and regulator of the structure of chromatin, controlling the expression of several other genes, making it a key protein in the development and maturation of the central nervous system (CNS). One of the proteins whose expression is controlled by MeCP2 is the brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a neurotrophin with essential functions in cell maturation and differentiation, synaptic plasticity and neuronal survival. Consequently, alterations in MeCP2 compromise BDNF expression levels and function, and this evidence has already been demonstrated in multiple studies in RTT animal models. Those studies have also shown that the increase in BDNF expression can reverse some of the dysfunctions and symptoms present in RTT animal models. However, the therapeutic use of BDNF is not yet applicable since the blood-brain barrier (BBB) is impervious to this neurotrophic factor, preventing it from reaching the brain and performing its functions properly. In an attempt to facilitate the effects of BDNF, new strategies have been developed involving, for example, the use of molecules that cross the BBB and potentiate the neuroprotective action of BDNF. One of the molecules that has deserved particular attention is adenosine. Adenosine is a CNS neuromodulator that exerts its functions through the activation of four receptors, A1, A2A, A3 and A2B (AR). In particular, the activation of A2AR is crucial for the maintenance of BDNF and its receptor, TrkB-FL (full-length tropomyosin-related kinase B), levels as well as for its synaptic effects. It is noteworthy that the adenosinergic system, in addition to be crucial in BDNF-mediated signaling, also has a prominent role in the control of synaptic excitability through the activation of inhibitory A1 receptors, recognized as potential therapeutic targets in the control of epilepsy. These actions of adenosine, as well as the presence of some symptoms in patients with RTT overlapping with diseases with adenosinergic dysfunction already described, suggest the possibility that this neuromodulator is also affected in RTT. Thus, this project aimed to: 1) characterize in detail the adenosinergic system and BDNF-mediated signaling, through the use of models with distinct phenotypes: 1.1) animal model with an severe phenotype, Mecp2-null mutant male mice (Mecp2-/ y); 1.2) animal model with a moderate phenotype, female mice heterozygous for Mecp2 (Mecp2+/-); and 2) explore the augmentation of adenosine levels as a possible therapeutic strategy. Through Western-Blot (WB) assays it was possible to detect decreased BDNF protein levels in hippocampus, cortex, brainstem, and cerebellum homogenates obtained from Mecp2-/y symptomatic animals. The changes detected in the pre-symptomatic stage were less marked, with only a decrease in BDNF levels observed in the striatum of 3-week-old Mecp2-/y animals. Also, in Mecp2+/- animals, decreases in BDNF levels were detected both in the cortex and in the hippocampus in the symptomatic stage. Regarding protein levels of BDNF receptors, decreases in TrkB-FL were observed in the symptomatic stage in cortical and hippocampal homogenates, and in the pre-symptomatic phase in the cortex and striatum. In this brain area, an increase in TrkB-FL levels was also observed in the symptomatic phase. Analyzing the protein levels of truncated isoforms of the TrkB receptor (TrkB-Tc), negative modulators of BDNF action, an increase were detected in brainstem homogenates from 1-week and 6-week-old animals. In Mecp2+/- animals, no alterations were detected in any of the studied BDNF receptors. Electrophysiological recordings performed in the hippocampus allowed the study of synaptic plasticity, namely through the study of long-term potentiation (LTP). In Mecp2-/y animals there was a decrease in the magnitude of LTP and an absence of the facilitatory effect of BDNF upon LTP. In Mecp2+/- animals, although the basal magnitude of LTP was not affected, BDNF also lost its ability to potentiate this phenomenon associated with synaptic plasticity. The study of the adenosinergic system, analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), allowed to detect a decrease in the levels of adenosine and its precursor adenosine monophosphate (AMP), both in hippocampal and cortical homogenates of Mecp2-/y animals in the symptomatic stage. Simultaneously, increases in protein levels of A1R in the cortex and hippocampus and a decrease in A2AR in the cortex were found. The same changes in adenosine receptors were found in Mecp2+/- animals, but also a decrease in A2AR levels in the hippocampus. Despite the decrease in BDNF levels, in both models, it was possible to recover the facilitatory effect of BDNF upon the magnitude of hippocampal LTP, through the activation of A2AR by the selective agonist CGS21680. These data supported the hypothesis that a therapy targeting the adenosinergic system could be beneficial. Thus, 5-6 weeks old Mecp2-/y animals were administered intraperitoneally with an adenosine kinase (ADK) inhibitor drug, 5-iodotubercidin (ITU). This drug allows an increase in adenosine levels by inhibiting its metabolism. In addition to the efficacy of ADK inhibition already demonstrated in other diseases, such as epilepsy models, in Mecp2-/y animals, by WB analysis, increased ADK protein levels were detected in cortex homogenates during the pre-symptomatic stage, supporting the study of ADK as a potential therapeutic target in RTT. Through the study of ITU administration, carried out in vivo, it was possible to observe a recovery of the effect of BDNF upon LTP potentiation, in electrophysiological recordings performed in hippocampal slices, as well as a recovery of protein levels of TrkB-FL receptors in hippocampal homogenates from ITU-treated Mecp2-/y animals. Overall, the results point to a dysfunction either in signaling mediated by BDNF and in adenosinergic system, in two different phenotypes of the disease, suggesting a possible involvement of both in the pathophysiology of the disease. The positive data obtained regarding the reversal of some deficits present in the animal models studied, through the pharmacological inhibition of ADK, reinforces the importance of adenosinergic system involvement while suggesting the increase of adenosine levels as a strategy to be explored in RTT.Universidade de Lisboa (BD2016

Metanálise sobre os impactos das alterações climáticas no zooplâncton marinho

Tese de Mestrado, Ecologia Marinha, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO clima da Terra é dinâmico, e muitas das mudanças passadas são atribuídas a causas naturais, mas as mudanças climáticas mais recentes estão associadas ao aumento das atividades antropogénicas. Estima se até 2100 se agravem os fenómenos de aquecimento (Aq) e acidificação (A) no oceano global, assim como processos de desoxigenação que levem à expansão de zonas hipóxicas (H). No oceano global, as comunidades zooplanctónicas são fundamentais em todas as teias tróficas marinhas. Sendo o zooplâncton sensível a alterações ambientais de curto-prazo, constituí um bom indicador da saúde dos ecossistemas, especialmente no contexto de alterações climáticas. O objetivo da presente dissertação foi realizar uma metanálise sequencial hierárquica de modelos mistos, para compreender como o zooplâncton marinho é afetado pelas alterações climáticas. Na metanálise foram incluídos trabalhos que cumprissem os seguintes critérios para os stressors selecionados: (A) - Δ de pH ≤ -0,41; (Aq) - Δ de 4°C; (H) - 0,5 e 4,5 O2 mg/l. No final do processo de seleção, foram incluídos 192 artigos científicos dos quais fizeram parte 1175 experiências. De forma geral, os stressors A+H (p = 0,426) e H (p = 0,918) não revelaram diferenças significativas, ao contrário dos stressors Aq+A (p = 0,036), A (p < 0,001) e Aq (p < 0,001), tendo o último stressor obtido a maior magnitude de efeito na amostra. O zooplâncton foi afetado negativamente pelo Aq e A e Aq+A. Os filos mais afetados foram o Chordata e Mollusca, especialmente nas fases inicial (ovos) e final (adultos) da ontogenia das espécies. Relativamente às respostas biológicas analisadas, a sobrevivência, o crescimento e desenvolvimento foram as mais afetadas pelos stressors analisados. Sendo estes organismos elos vitais em teias tróficas e serviços marinhos, é essencial a expandir o conhecimento sobre os efeitos das alterações climáticas, para melhor mitigar os seus efeitos.The Earth's climate is dynamic, with many of the past changes attributed to natural causes, while some more recent changes are related to human activities. It is predicted that by the end of the century ocean warming (W) and acidification (A) processes will continue to be worse, as well as deoxygenation pro cesses that lead to the expansion of hypoxic zones (H). In the global ocean, zooplankton communities stand out, since they are vital links in all oceanic food webs. As zooplankton is sensitive to short-term changes, they become a good indicator of ocean health in a climate change context. The aim of this dissertation was to carry out a hierarchical sequential meta-analysis of mixed models, to understand how zooplankton can be affected by climate change variables. The meta-analysis included scientific articles that met the following criteria for the selected stressors: (A) - pH Δ ≤ -0.41; (W) - Δ of 4°C; (H) - 0.5 and 4.5 mg/l O2. As a result, 192 scientific articles were included, including 1175 experiments. In the overall, stressors A+H (p = 0.426) and H (p = 0.918) did not reveal to trigger significant results, unlike stressors W+A (p = 0.036), A (p < 0.001) and W (p < 0.001), with the last stressor having the greatest magnitude of effect in the sample. In general, zooplankton were negatively affected by W and A and W+A. The most affected phyla were Chordata and Mollusca, especially in egg and adult stages. Regard ing the analyzed biological responses, survival, growth, and development were the most affected by the studied stressors. Since these organisms are vital links in food webs and marine services, it is essential to expand knowledge about the effects of climate change, to better mitigate its effects

Comparative analysis of oral epithelial cells from Human and Mouse using single-cell RNA sequencing data

Tese de mestrado, Bioinformática e Biologia Computacional, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasDifferent tissues respond differently to damage, such as scar formation, pain level, and healing time. Oral mucosa is a tissue with a high potential to heal faster and scarlessly than other tissues, such as the skin. Differences in the healing process result from a combination of factors, such as structure, microenvironment, subpopulations of fibroblasts and dynamics of keratinocyte proliferation. However, the heterogeneity of tissues in the oral mucosa and their cellular and molecular diversity have not yet been thoroughly studied. Next-generation sequencing technologies, such as single-cell RNA sequencing (scRNA-seq), allow the study of tissue heterogeneity of tissues, allowing the detection of new cell types and subpopulations. In this study, we compared epithelial cells in oral tissues from two species, Homo sapiens and Mus musculus, using bioinformatics tools to disclose the gene markers related to scarless and fast healing processes in this tissue. We used machine learning algorithms to analyse the scRNA-seq data from pre-processing until the results. We expanded our analysis using RNA velocity analysis, a crucial tool in our study for characterising the developmental trajectory of differentiating cells. This dissertation identified similar gene signatures and behaviours between tissues and from the two species. Our research displayed subpopulations found in other studies and tissues, and identified different behaviours in their stem cells subpopulation. Overlapping the data from the two species highlighted more similarities between the tissues of human buccal and mouse hard palate tissues than between buccal tissues from both species. Other in silico and in vitro approaches should be followed to validate the results. Testing this finding could be game-changing in the study of the wound healing process, with possible patient benefits. Also, integrating the Oral and Craniofacial Human Cell Atlas is a future aim for others to be able to use the data obtained

The works of homemaking: migration, domestic materiality, and everyday life

What are the potentialities and limitations of an ethnographic approach to the material aspects of contemporary migrations? What does the study of domestic materiality and homemaking in contexts of migration reveal about movement and its outcomes? By addressing these two questions, this chapter aims to contribute to further consolidating the study of material culture and consumption practices in migration contexts and discuss the empirical advantages of tackling contemporary circulations of people through a focus on things, in general, and on things from home, in particular.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Lisinas codificadas por profagos de Acinetobacter baumannii

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAcinetobacter baumannii é um agente patogénico Gram-negativo, oportunista e responsável pela maioria das infeções nosocomiais em todo o mundo. Nos últimos anos, este microrganismo tem adquirido resistência aos diversos antibióticos comercializados, sendo maioritariamente auxiliado pelos seus fatores de virulência, pela excelente capacidade de resistir à dessecação, desinfeção e stress oxidativo, pela capacidade de formar biofilmes, por se mover pelas superfícies e por ser capaz de adquirir DNA exógeno. Particularmente, A. baumannii resistente a carbapenemos (CRAB), foi decretado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como um microrganismo prioritário que requer atenção e o desenvolvimento imperativo de novas opções terapêuticas. As (endo)lisinas fágicas apresentam-se como uma opção promissora, uma vez que são responsáveis por clivar as ligações no peptidoglicano a partir do interior, levando à lise das células hospedeiras durante o ciclo lítico do fago. Sabe-se que a aplicação de endolisinas a partir do exterior e diretamente em bactérias Gram-positivas provoca a sua lise e que, teoricamente, o mesmo não é esperado quando aplicadas em bactérias Gram-negativas devido à presença da membrana externa. Esta barreira poderá ser ultrapassada através da encapsulação das endolisinas em lipossomas, tirando partido da fusão desta estrutura com a membrana externa da bactéria. Contrariamente ao expectável, já foram relatadas algumas lisinas com atividade bactericida intrínseca direta contra A. baumannii. Os profagos (genomas fágicos integrados) em genomas de A. baumannii constituem uma fonte acessível para a pesquisa destas proteínas. Da análise dos 199 genomas de A. baumannii considerados neste projeto, foram detetados 373 profagos putativos e 311 lisinas putativas codificadas na totalidade das regiões profágicas identificadas. As lisinas selecionadas, AbCWH, AbLyso, AbPepti, AbProte e AbTail, foram clonadas e expressas com sucesso tendo todas apresentado atividade bactericida contra a bactéria Gram-positiva Micrococcus luteus. Em particular, AbTail apresentou atividade direta contra A. baumannii sendo a sua estrutura alvo de análise.Acinetobacter baumannii is a Gram-negative and opportunistic pathogen, responsible for most nosocomial infections worldwide. In recent years, this microorganism has acquired resistance to various antibiotics commercialized, being mostly promoted by its virulence factors, by the excellent ability to resist desiccation, disinfection and oxidative stress, by the ability to form biofilms, by moving across surfaces and by being able to acquire exogenous DNA. In particular, carbapenem-resistant A. baumannii, was decreed by the World Health Organization as a priority microorganism that requires attention and the imperative development of new therapeutic options. Phage (endo)lysins are a promising option to consider, since they are responsible for cleaving the peptidoglycan bonds from the inside, leading to lysis of the host cells during the lytic cycle of the phage. It is known that the application of endolysins from the outside and directly in Gram-positive bacteria causes its lysis and that, theoretically, the same is not expected when applied to Gram-negative bacteria due to the presence of the outer membrane. This barrier can be overcome by encapsulating endolysins in liposomes, taking advantage of the fusion of this structure with the outer membrane of the bacterium. Contrary to expectations, some lysins with direct intrinsic bactericidal activity against A. baumannii have been reported. The prophages (integrated phage genomes) in A. baumannii genomes constitute an accessible source for the research of these proteins. From the analysis of the 199 genomes of A. baumannii considered in this project, 373 putative prophages and 311 putative lysins were detected encoded in all the identified prophagic regions. The selected lysins, AbCWH, AbLyso, AbPepti, AbProte and AbTail, were cloned and successfully expressed and all presented bactericidal activity against the Gram-positive bacterium Micrococcus luteus. In particular, AbTail showed direct activity against A. baumannii being its structure explored later

Unveiling the role of DIPK2B in zebrafish myeloid cell development

Tese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA hematopoiese é um processo que ocorre desde a embriogénese e até à vida adulta de todos os animais vertebrados. Ao longo dos anos o peixe-zebra tem-se tornado um modelo muito utilizado para estudar a hematopoiese, uma vez que apresenta vantagens que facilitam o estudo do seu desenvolvimento, tais como a fertilização externa e a transparência dos embriões. Adicionalmente, os genomas do peixe-zebra e dos mamíferos apresentam uma elevada similaridade, a qual também se observa em numerosos genes associados a doenças. Para além disso, há também uma grande homologia nos mecanismos genéticos e regulatórios que controlam a hematopoiese no peixe-zebra e nos mamíferos, apesar deste processo ocorrer em tecidos e órgãos distintos. Durante o desenvolvimento embrionário dos peixes, a primeira onda de hematopoiese dá origem aos eritrócitos primitivos, que levam oxigénio aos tecidos embrionários, e aos macrófagos primitivos, que migram para diferentes localizações no embrião onde se diferenciam em macrófagos residentes de tecidos. No sistema nervoso central, estas células são definidas como microglia. A segunda onda de hematopoiese ocorre numa fase mais tardia do desenvolvimento, e é responsável pela formação de células hematopoiéticas estaminais progenitoras, que migram para diferentes tecidos e estabelecem-se como células hematopoiéticas estaminais na medula do rim do peixe-zebra, o tecido equivalente à medula óssea dos mamíferos. É neste tecido que as células hematopoiéticas estaminais dão origem às várias linhagens celulares do sangue durante toda a vida do organismo, tais como os eritrócitos, monócitos, granulócitos e linfócitos. Na maioria dos órgãos, os macrófagos residentes de tecidos, de origem primitiva, são gradualmente substituídos por macrófagos definitivos derivados de monócitos, com origem em células hematopoiéticas estaminais. Devido às diferentes origens dos macrófagos residentes de tecidos, defeitos genéticos em qualquer uma dessas populações podem ter consequências distintas para o desenvolvimento hematopoiético do organismo. Distúrbios no normal desenvolvimento dos macrófagos primitivos levam a defeitos nos macrófagos residentes de tecidos embrionários, os quais podem afetar o desenvolvimento dos órgãos onde estes se localizam. Um destes órgãos é o cérebro, cujo normal desenvolvimento depende em grande medida da atividade da microglia primitiva. Por outro lado, se o defeito ocorrer nas células hematopoiéticas estaminais, os macrófagos definitivos podem não se desenvolver normalmente, o que compromete a imunidade inata do organismo adulto. Alterações no desenvolvimento hematopoiético podem levar a distúrbios relacionados com o sistema imunitário, tais como as perturbações do espetro do autismo (PEA) e as imunodeficiências primárias (IDP). Nomeadamente, mutações em genes que regulam a função e/ou o desenvolvimento da microglia têm sido associadas a defeitos no neurodesenvolvimento e a PEA. É de notar que a microglia desempenha funções essenciais para o normal desenvolvimento do cérebro, tais como a regulação da neurogénese e da apoptose neuronal, a fagocitose de células mortas, a poda sináptica e a remodelação de circuitos neuronais. As PEA são doenças do neurodesenvolvimento caracterizadas por defeitos na interação social e a presença de comportamentos ou interesses repetitivos e restritos. Dentro deste espetro, os cinco principais tipos são: a Perturbação Autística, a Síndrome de Asperger, a Perturbação Desintegrativa da Segunda Infância, a Síndrome de Rett e a Perturbação Global de Desenvolvimento sem outra especificação. Por outro lado, mutações que afetam o desenvolvimento das células hematopoiéticas estaminais podem comprometer o desenvolvimento e/ou a função do sistema imunitário, como ocorre nas IDP. As IDP são um grupo heterogénio de doenças crónicas causadas por mutações de novo ou hereditárias e com diversos fenótipos provocados por defeitos imunes, tais como infeções recorrentes, autoimunidade, inflamação aberrante e aumento do risco de doenças hematológicas malignas. Em particular, as IDP associadas a deficiências nos macrófagos são as seguintes: a Doença Granulomatosa Crónica, a Suscetibilidade Mendeliana a Infeções Micobacterianas e a Síndrome da Cinase de 3- Fosfoinositol δ Ativada. Neste projeto, abordamos o papel de um gene implicado em PEA e IDP que é expresso nos progenitores das células hematopoiéticas, o gene DIPK2B (Divergent Protein Kinase Domain 2B; também conhecido por DIA1R, Deleted in Autism 1 Related). A proteína DIPK2B possui um péptido sinal na região N-terminal seguido de um possível local de clivagem, indicando assim que esta proteína será translocada para o retículo endoplasmático e transportada para o aparelho de Golgi. Adicionalmente, as proteínas DIPK2B têm um domínio de proteína quinase PIP49_C altamente conservado, característico da família de proteínas quinases FAM69. Contudo, não possuem um domínio catalítico conservado, sugerindo que DIPK2B pode ser uma cinase atípica ou uma pseudocinase. Deleções e duplicações do gene DIPK2B foram encontradas em pacientes que apresentam fenótipos associados a PEA, enquanto mutações pontuais neste gene foram encontradas em pacientes com IDP. Estudos efetuados no passado por investigadores do nosso laboratório mostraram que embriões de peixe-zebra com knockdown de dipk2b apresentavam um nível de expressão superior de marcadores de células percursoras hematopoiéticos e um nível de inferior de marcadores de células hematopoiéticas diferenciadas relativamente aos seus controlos. Adicionalmente, estudos de quantificação da microglia no cérebro de larvas homozigóticas mutantes para este gene apresentavam um menor número de células da microglia do que os respetivos controlos. Estes resultados, bem como a implicação do gene DIPK2B em patologias como as PEA e IDP, sugerem que este gene restringe o número de células precursoras hematopoiéticas e promove a sua diferenciação em macrófagos e microglia. Neste projeto, pretendemos investigar o papel do gene dipk2b no desenvolvimento hematopoiético do peixe-zebra. Para isso, avaliamos o efeito do knockout deste gene na viabilidade de embriões e adultos através de uma análise das razões Mendelianas dos descendentes de cruzamentos de mutantes heterozigóticos. Esta análise revelou que dipk2b não parece ser essencial para a viabilidade do peixe-zebra. Concomitantemente, o efeito do knockout de dipk2b no desenvolvimento de diferentes populações hematopoiéticas foi avaliado através da análise de imagens de microscopia confocal e citometria de fluxo de embriões transgénicos que expressam proteínas fluorescentes especificamente nessas populações. Nomeadamente, a linha Tg(gata1a:DsRed);dipk2b foi utilizada para avaliar o efeito do knockout deste gene na população de progenitores eritromielóides, enquanto a linha Tg(mpeg:LRLG);dipk2b foi usada para estudar o papel deste gene no desenvolvimento dos macrófagos. Neste estudo não foram encontradas alterações na população de progenitores eritromielóides, apesar de estudos anteriores de investigadores do nosso laboratório terem mostrado que o gene dipk2b possa restringir o tamanho da população destas células. No entanto, o número de macrófagos é significativamente inferior nos mutantes homozigóticos quando comparados com os respetivos controlos. Assim, na fase embrionária, o papel deste gene parece consistir em promover o desenvolvimento dos macrófagos. Adicionalmente, foi também avaliado o efeito do knockout de dipk2b nas principais populações hematopoéticas de peixes adultos. Em particular, foram avaliadas as percentagens das populações de eritrócitos, linfócitos, mielomonócitos e precursores hematopoiéticos localizadas no sangue periférico, no baço e no rim de peixes adultos. Esta análise revelou que, no geral, as populações hematopoiéticas do rim e do sangue não parecem estar alteradas em mutantes para dipk2b, mas os baços de mutantes apresentam uma maior percentagem de mielomonócitos do que os de animais controlo. Este fenótipo recapitula alguns dos defeitos observados num modelo de peixe-zebra para leucemia mieloide aguda, uma neoplasia maligna hematopoiética frequentemente encontrada em pacientes com IDP. De modo geral, os nossos resultados sugerem que o dipk2b tem um papel importante no desenvolvimento hematopoiético da linhagem mieloide, promovendo o desenvolvimento dos macrófagos. Esta investigação contribui assim para esclarecer a função do gene DIPK2B na patogénese de subtipos de PEA e IDP relacionados com a disfunção de macrófagos.Hematopoiesis is a process that starts during embryogenesis and continues throughout adult life. In the embryo, a first wave of hematopoiesis gives rise to primitive erythrocytes, which oxygenate the embryonic tissues, and to primitive macrophages, which migrate into the tissues and become tissue-resident macrophages, such as the microglia in the brain. A second wave of hematopoiesis occurs later in development and is responsible for generating hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) that persist throughout an organism's life, giving rise to all blood cell lineages. Disruptions in hematopoietic development can lead to immune-related disorders, such as autism spectrum disorders (ASD) and primary immunodeficiencies (PID). Namely, genetic mutations that affect the development of microglia have been associated with defects in neurodevelopment and ASD, whereas those affecting the development of HSPCs have been associated with immune disorders and PID. In this project, we addressed the role of a gene implicated in ASD and PID that is expressed in the progenitors of hematopoietic cells, the gene DIPK2B (Divergent Protein Kinase Domain 2B). In particular, we investigated the effects of dipk2b loss of function in the hematopoietic development of zebrafish. In transgenic embryos expressing fluorescent proteins in different hematopoietic populations, we used confocal microscopy and flow cytometry to assess the number of erythromyeloid progenitors and macrophages. Our results showed that dipk2b mutant embryos have less macrophages then their respective controls. In adult zebrafish, we used flow cytometry to quantify the percentages of different hematopoietic cell populations in the peripheral blood, spleen and kidney marrow. In dipk2b mutant fish, the blood and kidney hematopoietic cell populations appeared unchanged, but the spleen had a significantly higher percentage of myelomonocytes than controls. Overall, our findings suggest that dipk2b plays a crucial role in the development of myeloid cells, which may underly its implication in ASD and PID