Nippon Verterinary and Life Science University Repository / 日本獣医生命科学大学学術リポジトリ

生命科学総合研究センター紀要 第2巻

日本獣医生命科学大学博士（獣医学）令和４年度doctoral thesi

田中, 祥代

タナカ, サチヨ

1      A study of the cardiac effects of long-term high-dose prednisolone administration in dogs  Summary of Doctoral Thesis     Sachiyo Tanaka    Graduate School of Veterinary Medicine and Life Science  Nippon Veterinary and Life Science University   2  Hyperadrenocorticism (HAC) is recognized as a major endocrine disorder in dogs. Cushing syndrome (CS) caused by HAC in dogs presents with systemic changes due to excess cortisol, a glucocorticoid (GC) in the blood. It is known that in patients with HAC in human medicine, as in dogs, excessive production of cortisol causes systemic changes. The presence of left ventricular hypertrophy (LVH) and diastolic dysfunction (DD) has also been reported in human patients with HAC. In addition, histopathological changes in the heart of HAC patients have been reported to include hypertrophy of cardiomyocytes and increased collagen fibrosis in the myocardium. On the other hand, it has recently been reported in veterinary medicine that left ventricular wall thickness (ILVWT) and DD occur in HAC-affected dogs. It has also been reported that ILVWT and DD occurred in healthy beagle dogs treated with high dose (2 mg/kg, every 12 hours) of prednisolone, a synthetic GC preparation, for 28 days. Furthermore, left ventricular remodeling in human and canine HAC cases, has been reported to be affected by the duration of hypercortisolemia. However, to the best of our knowledge, the structural and functional effects of long-term prednisolone administration in dogs on the myocardium, histopathological changes in myocardial tissue, and the mitral valve tissue, the atrioventricular valve of the left heart system, have not been reported when hyperglucocorticism (HGC) is sustained for a long time. Therefore, the purpose of this study was to investigate the effects of long-term administration of high-dose prednisolone on the heart by evaluating the morphological and functional evaluation and the histopathological changes by administering high-dose prednisolone for 84 days.   Chapter 2 The effects of long-term prednisolone administration of HGC to dogs on cardiac 3  morphology and function had not been investigated. Therefore, we conducted a study to evaluate the morphological and functional effects of long-term prednisolone-induced HGC on the heart over time. The results showed that morphologically, ILVWT occurred, and functionally, left ventricular diastolic function was reduced. None of the common echocardiographic findings correlated with systolic blood pressure (SBP), and these results were consistent with recent reports in veterinary medicine. The new finding of a negative correlation between SBP and peak velocities of left ventricular myocardium at early diastole (Em) on the ventricular septal side, suggests that glucocorticoid-induced hyper blood pressure may have an effect on reduced left ventricular DD.  Chapter 3 Chapter 2 revealed that morphological and functional changes in the heart in dogs with sustained HGC caused by long-term prednisolone administration, but the causes of these changes were not clear. Therefore, in Chapter 3, we aimed to investigate the causes of ILVWT and DD in dogs with persistent HGC by examining the histopathological changes in the hearts of the model dogs created in Chapter 2 and correlating them with the results of Chapter 2. The results showed that the percentage of collagen fibers in the left ventricular free wall and ventricular septum. There was a positive correlation between the percentage of area occupied by collagen fibers in the ventricular septum and the end-diastolic ventricular septal wall thickness and left ventricular mass on echocardiography, and a negative correlation between the percentage of area occupied by collagen fibers in the ventricular septum and the Em on the ventricular septum side in the same dogs reported in Chapter 2. Therefore, it is speculated that left ventricular fibrosis may be associated as one of the causes of LVH and DD reported in HAC 4  dogs and in dogs receiving prednisolone experimentally. The percentage of glucocorticoid-receptor (GCR) in left ventricular myocardium was significantly decreased in prednisolone-treated dogs (P group) compared to healthy dogs (C group), and the mineralocorticoid receptor (MCR) was significantly increased in the P group compared to the C group. Thus, it is possible that excess GC downregulated the GCR, and more GC bound to and activated the upregulated MCR. Histological studies on mitral valve tissue, revealed possible histological changes in the P group, including decreased collagen fiber and acidic sulfated mucosubstances deposition and increased trabecular layer thickness with associated increased fat cell occupied areas. Decreased sulfated mucus material and collagen deposition may lead to mechanical abnormalities such as primarily decreased resistance to mechanical loading.   Chapter 4 Chapter 2 revealed that fibrosis of the left ventricular myocardium occurs in dogs with persistent HGC due to long-term prednisolone administration. In Chapter 4, we aimed to investigate the mechanism by which HGC causes fibrosis of the left ventricular myocardium. The results showed that the percentage of angiotensin II type 1 receptor (AT1R), 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8OHdG), and transforming growth factor β1 (TGFβ1) in myocardium and aorta in P group was significantly higher than that in group C. In the present study, the increase in AT1R in the myocardial tissues of the P group may have resulted in increased Angiotensin II stimulation, leading to an increase in 8OHdG, an oxidative stress marker. These results may support the hypothesis that in left ventricular myocardium in dogs with HGC, increased oxidative stress in the myocardium activates the GC-MCR complex, which increases the 5  expression of TGF-β1, a potent inducer in myocardial fibrosis, resulting in fibrosis. On the other hand, a significant increase in SBP at 84 days after the start of prednisolone medication in the P group, suggests that the increase in TGF-β1 expression in the myocardium may have been caused by increased Angiotensin II stimulation due to increased AT1R, which is associated with increased blood pressure. Although the mechanism of GC-induced hypertension has not been fully elucidated, it has been reported that increased oxidative stress in the blood of hypertensive rats plays an important role in the development of hypertension by causing vasoconstriction through inactivation of nitric oxide.  Thus, it is possible that in the P group, the increase in vascular oxidative stress itself led to the increase in blood pressure, and the increase in TGF-β levels in the myocardium and aorta tissue that accompanied the increase in blood pressure.  In summary, this study was conducted to investigate the effects of HGC on the heart. The results indicate that HGC may cause ILVWT and DD associated with fibrosis of the left ventricle, and may be involved in the degeneration of mitral valve tissue. The results also revealed that the mechanism by which HGC induces myocardial fibrosis may involve increased Angiotensin II stimulation and oxidative stress. These results obtained in this study may contribute to the elucidation of the cardiovascular effects of HGC, following recent reports, and further research in this area is expected in the future. 

Japanese

犬における高用量プレドニゾロン長期投与が心臓に及ぼす影響に関する研究

日本獣医生命科学大学博士（獣医保健看護学）令和４年doctoral thesi

本田, 三緒子

ホンダ, ミオコ

Study on food safety of origin and game meat at Japan    Abstract of Doctoral Thesis    Mioko Honda     Graduate School of Veterinary Medicine and Life Science Nippon Veterinary and Life Science University      In recent years, when cooking and processing derived from Game meat, correct knowledge of zoonotic diseases such as food poisoning bacteria, parasites that cause symptomatic complaints, Hepatitis E and Severe Febrile Thrombocytopenia Syndrome are required, and the need for research on the food safety of meat derived from wild birds and animals (from Japan) is increasing. Therefore, in this study, focusing on the genus Sarcocystis, a Prozoa :Apicomplexa that parasitizes in the deer meat of Japanese deer, which has relatively few research reports, we re-evaluated the safety of food by resistance experiment of Sarcocystis and examined the detection sensitivity of pathogenic bacteria adapted to the prevention of the occurrence of food poisoning.  Chapter 2 examines the resistance of Sarcosisis fayeri, a parasite that causes diarrhea symptoms in humans by eating raw-horse meat stings and the like, and since there have been reports of cases similar to raw-horse stings in deer meat, Sarcocystis Resistance was examined using storage, heating, refrigeration, freezing, salting, and acid and alkaline treatment as indices. As a result, it was inactivated at −20 °C for 2 hours, −30 °C for 1 hour, and −80 °C for 1 hour under freezing conditions, survived for 7 days (168 hours) at 0 °C and 4 °C, and was inactivated at 70 °C for 1 minute and 65 °C for 3 minutes under heated conditions, and only 30% inactivity was confirmed at 55 °C for 3 minutes.  It was also confirmed by the analysis of Sarcocystis diarrheal toxin (15 kDa protein) using the stun blotting method. In the salt storage, inactivation was confirmed in 24 hours with 6% salt and 2% coloring agent, and with 2.5% salt and 0.25% coloring agent. The above results were able to present certain conditions for the treatment of deer meat based on scientific grounds for the prevention of food poisoning by Sarcocystis parasites.  In Chapter 3, Salmonella and Listeria were experimentally added to commercially available prosciutto and deer meat, and direct testing and sterilization at 37 °C were compared using commercially available detection reagent kits using the LAMP method and the RT-qPCR method. As a result, it was revealed that the detection sensitivity of the sterilization test method was better than that of the direct test method under this experiment. In addition, in the RT-qPCR method and the LAMP method, the detection sensitivity was high in this experiment by the LAMP method. In addition, if the sterilization test is applied, both methods seem to be effective because bacteria can be sufficiently detected even by the RT-qPCR method. The above results have presented a certain level of knowledge that can contribute to the field of veterinary health nursing in considering the food safety of wild birds and be Game meat (from Japan), such as deer meat. In the future, it was thought that it would be necessary to investigate the relationship between the number of bacteria and harmful symptoms based on this research. 

野生鳥獣由来肉（日本産）の食の安全に関する研究

氏家, 誠

50415478

1牛トロウイルスのリバースジェネティクスの確立氏　家　　誠日本獣医生命科学大学　獣医学部　獣医学科　獣医感染症学研究室　准教授日獣生大研報 71，1-2，2023.─────────────────────────────────────要　　　　旨試験管内で合成したウイルス遺伝子を細胞に導入して、感染性ウイルスを人工合成する技術を「リバースジェネティクス（RG）」と呼びます。この技術を用いると、ウイルスがなぜ病気を起こすのか、ウイルスの増殖を止めるにはどのような薬を作れば良いのかなどを、ウイルスゲノムを直接操作して研究できるようになり、ワクチンや治療薬の開発を飛躍的に進展させることができます。このため RG は、現代のウイルス学において最も重視されている技術の一つです。本研究では、この技術を使って世界で初めて牛トロウイルス（BToV）の人工合成に成功しました。今回、確立した牛トロウイルスの RG によって、BToV ゲノムを自由に改変できるようになり、ウイルスの増殖機構の解明や新規ワクチン開発などが飛躍的に進展することが期待されます。は　じ　め　に牛トロウイルス（BToV）は、ニドウイルス目トバニウイルス科トロウイルス（ToV）亜科に属する、エンベロープを持つ 1 本鎖プラス鎖 RNA ウイルスです。BToV は仔牛の下痢の原因ウイルスであり、1979 年にアメリカで発見されて以来、日本を含む世界各国で検出されています。ToV は、以前はコロナウイルス（CoV）科に属していたため、ToVと CoV は見た目も性質もよく似ています。しかしながら、その注目度は大きく異なり、CoV は新型コロナを初めとして医学や獣医学領域で重要なウイルスを多く含むため、広く研究されてきました。一方、ToV は通常無症状か軽症なためあまり注目されず、ほとんど研究されてきませんでした。実際、発表論文数を比較してみると、CoV 科に関する論文は、新型コロナが流行する以前でも約 16,500 報あるのに対して、ToV は現在までにわずか 242 報しかなく、超マイナーウイルスであることがわかります。本学着任前の著者は、インフルエンザや CoV の研究をしていましたが、本学着任後は激しい競争をさけるために、競争相手の少ないこの超マイナーウイルスを研究対象の一つに加えることにしました。牛トロウイルスのリバースジェネティクス（RG）の確立トロウイルスを研究対象にすれば、激しい競争から離脱してのんびり研究できると思ったのですが、誰も扱っていないウイルスであったため、確立されたアッセイ系や各種抗体がなく、興味深いデータは得られるもののそれ以降の研究が進まない状況が続きました。特に、ToV のリバースジェネティクス（RG）は極めて困難であるため、RG が確立されておらず、これも研究の大きな障壁となっていました。実は RG の難易度は、ウイルス科によって大きく異なり、例えば RNAウイルスの中で最もシンプルなピコルナウイルス科の RG は1981 年に成功したのに対し、最大の RNA ゲノムを持つCoV 科の RG はその 19 年後の 2000 年に成功しました。CoV科の RG は 2 つの主流な方法があり、全長ゲノムを BAC（大腸菌人工染色体）に組み込み細胞に導入する方法（Enjuanes法）1）と、数個の断片に分けた遺伝子を試験管内でつなぎ合わせ、そこからウイルス遺伝子を転写し細胞に導入する方法（Baric 法）2）があります。理屈だけ聞くと簡単ですが、CoV科の RG の難しさは有名で、例えば Baric 法ではラボ内で同じ材料と同じ試薬を使いながら、実際に操作できるのは職人技をもつ古参の研究者のみといった具合です。このため、CoV によく似た ToV も、RG が極めて困難であると言われていました。転機が訪れたのは、大阪大学微生物病研究所の神谷亘先生（現群馬大学大学院医学系研究科 生体防御学講座 教授）にお会いしたことで、神谷先生は国内で初めて Enjuanes 法を使って猫コロナの RG に成功しました 3）。BToV の RG について相談すると、共同研究者として全面的にサポートしてくださることになり、さらに、このころ、2 人の熱心で優秀な学生（江藤由佳さんと漆山尚也さん）に出会うことができました。そこで、機は熟したと感じ、4-5 年かかることを覚悟して着手したのです。幸いにも、神谷先生のサポートと学生らの甚大な努力のおかげで、わずか 2 年ほどで BToV の RGに成功しました。このように書くと順調に進んだように見えますが、BToV のゲノムは 30kb ほどあり、Enjuanes 法ではこれを 10 断片に分けて、大腸菌内の相同組み換えを利用して BAC に組み込んでいきます。1 断片組み込むのに約 2 週間かかるため、なんのトラブルもなく休まず働いても 5-6 か月かかる大仕事です。学生らは実習・講義・定期試験の合間を縫って、1 年半ほどの驚異的なスピードで全ゲノムの組み込みを終わらせました。梅野賞受賞研究日本獣医生命科学大学研究報告　第 71 号（2023）2ところが、期待に胸を膨らませて行った最初の実験では、人工ウイルスを作ることができず、ひどく落胆します。あとで理由が判明するのですが、BToV のゲノムの一部は大腸菌に強い毒性を持つため、この毒性を中和するために大腸菌由来の遺伝子が意図しない形で BToV ゲノムに挿入されていました。そこで、この大腸菌由来の余分な遺伝子を除去するために、様々な方法をトライするのですが、何をやっても上手く行かず関係者全員の心が折れ始めた半年後にようやく成功したのです。このようなわけで、2 年かかった RG の最後の半年間は心身ともに疲弊することになりました。幸いにも、苦労して確立した RG は、様々な仕事に応用でき（レポーター遺伝子発現 BToV やウイルスタンパク質の機能解析など）4-5）、現在は RG を使った次世代ワクチンの開発なども手掛けており、今後も研究の幅が大きく広がっていきそうです。さ　い　ご　に先日、とある学会の会場で、当研究室出身の学生（東京大学大学院　岩田修二さん）にこんなことを言われました。「僕が、研究室見学に行った時に（おそらく 7-8 年前に）、氏家先生が『難しいけど、トロウイルスのリバースジェネティクスにチャレンジしてみたい』と言っていたのをよく覚えています。成功して本当に良かったですね。おめでとうございます。できることが広がって、今の学生が本当にうらやましいです。」と告げられ、とても嬉しく思いました。また、ウイルス学の分野では、Journal of Virology（J.Virol）がトップジャーナルの一つとして認識されていますが、責任著者として J.Virol に研究成果を載せることを目標にしていました。目標達成にずいぶん時間がかかりましたが、今回の RG 関連の仕事で、2 報の J.Virol に掲載 4-5）することができ、これも本当に嬉しかったです。我々が 2 年間かかった BToV の RG ですが、技術は日進月歩であり、新型コロナの RG には新しい技術が開発され、わずか 1 か月で RG が確立されました 6）。（この技術を使えば、ToV も理論上は 1 か月でできます！）その後も、簡便な RG 法が開発され続けています 7）。とはいえ、ToV は依然として超マイナーウイルスであるため、BToV の RG にチャレンジするモノ好きな研究者はおらず、当分この技術は我々の研究室だけで独占できそうです。最後に、著者は ToV 研究と並行して CoV 研究も続けており、最近は共著ながらも大変興味深い仕事に携わることができました 8-9）。今後も、ToV や CoV 研究において、質の高い研究が行えるように努力していきたいです。謝　　　　辞この度は名誉ある梅野信吉賞を頂きまして、大変光栄に存じます。受賞に際しましては清水学長をはじめ、選考委員会の先生方、本賞へのご推薦をいただきました田中良和教授、さらには副賞を贈呈いただきました同窓会の皆様に謹んでお礼申し上げます。本研究にあたり、神谷亘教授（群馬大学）、Enjuanes 教授（CNB-CSIC）および田口文広前教授からは多くの助言と励ましを頂き心から感謝いたします。また、本研究は、卒業生の江藤由佳さんおよび漆山尚也さんの両学生が中心となって行い、その他多くの卒業生が関与してくださいました。彼らの知恵と尽力に、心より感謝いたします。最後に、日々の研究を見守ってくれる家族に心よりお礼いたします。文　　　献1） Almazán F, González JM, Pénzes Z, Izeta A, Calvo E, Plana-Durán J, and Enjuanes L. (2000) Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial ar-tificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 97:5516-21.2） Yount B, Curtis KM, and Baric RS. (2000) Strategy for systematic assembly of large RNA and DNA genomes: transmissible gastroenteritis virus model. J Virol. 74:10600-11. 3） Terada Y, Kuroda Y, Morikawa S, Matsuura Y, Maeda K, and Kamitani W. (2019) Establishment of a Virulent Full-Length cDNA Clone for Type I Feline Coronavirus Strain C3663. J Virol. 93:e01208-19. 4） Ujike M, Etoh Y, Urushiyama N, Taguchi F, Asanuma H, Enjuanes L, and Kamitani W. (2022) Reverse Genet-ics with a Full-Length Infectious cDNA Clone of Bovine Torovirus. J Virol. 96:e0156121.5） Ujike M, Kawachi Y, Matsunaga Y, Etho Y, Asanuma H, Kamitani W, and Taguchi F. (2021) Characterization of Localization and Export Signals of Bovine Torovirus Nucleocapsid Protein Responsible for Extensive Nuclear and Nucleolar Accumulation and Their Importance for Virus Growth. J Virol. 95:e02111-20. 6） Thi Nhu Thao T, Labroussaa F, Ebert N, V'kovski P, Stalder H, Portmann J, ( 他 21 名 ), and J, Thiel V. (2020) Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform. Nature. 582:561-565. 7） Torii S, Ono C, Suzuki R, Morioka Y, Anzai I, Fauzyah Y, Maeda Y, Kamitani W, Fukuhara T, Matsuura Y. (2021) Establishment of a reverse genetics system for SARS-CoV-2 using circular polymerase extension reac-tion. Cell Rep. 35:109014. 8） Matsuyama S, Kawase M, Nao N, Shirato K, Ujike M, Kamitani W, Shimojima M, and Fukushi S. (2020) The Inhaled Steroid Ciclesonide Blocks SARS-CoV-2 RNA Replication by Targeting the Viral Replication-Tran-scription Complex in Cultured Cells. J Virol. 95:e01648-20. 9） Li Y, Watanabe E, Kawashima Y, Plichta DR, Wang Z, Ujike M ( 他 25 名 ), and Honda K. (2022) Identification of trypsin-degrading commensals in the large intestine. Nature. 609:582-589. ──────────────────

牛トロウイルスのリバースジェネティクスの確立

172021 年度日本獣医生命科学大学若手研究者研究支援経費（研究成果報告書）1． WOREE症候群の病理学的特性と病態発生メカニズムの解明研究代表者　獣医学部獣医生理学　　　　　　准教授　栃木裕貴研究実績の概要WWOX遺伝子の変異に起因して重篤な神経症状を呈するWOREE 症候群のモデル動物として認知されている LDEラットの中枢神経系では、ニューロンやオリゴデンドロサイトの成熟が損なわれることが示されている。さらに、ニューロン特異的なWwox の欠損がこれらの細胞異常の原因であることが示唆されているが、そのメカニズムは不明である。本研究では、これらの細胞の成熟を促す神経伝達物質GABAに着目し、LDE ラットにおいて GABAニューロンの障害の程度を評価した。また、GABAニューロンの分化を刺激する甲状腺ホルモン（TH）に着目し、その治療効果を検討した。生後成長期の LDE ラットの大脳皮質において、GABAニューロンの特異マーカー Parvalbumin (PV)、Calretinin (Cal)、Somatostatin (Sst) を用いてその分布を調査したところ、PV陽性ニューロンのみが有意な減少を示した。このPV陽性ニューロンの減少は、THの投与により、正常と同等のレベルにまで改善することが示された。ノックアウトマウスでの研究から、ニューロンにおけるWwox の欠損が表現型の主要な原因であると考えられている。本研究より得られた結果は、PV陽性 GABAニューロンの発生が特異的に障害されることで、二次的に他のニューロンやオリゴデンドロサイトの異常が引き起こされている可能性を示す。さらに、このことは LDE ラットでの外因性THによる髄鞘形成が GABAニューロンの救済を伴っていたことで裏付けられた。遺伝子治療のみが唯一の治療法として検討されているWOREE 症候群に対し、甲状腺ホルモン投与という古典的な方法の有効性が示唆された。研究発表〔雑誌論文〕1）Md Abdullah Al Mahmud, Maki Noguchi, Ayaka Domon, Yuki Tochigi, Kentaro Katayama, Hiroetsu Suzuki. Cellular Expression and Subcellular Localization of Wwox Protein During Testicular Development and Spermatogenesis in Rats. J Histochem Cytochem. 69. 2021. 257-270. 10.1369/0022155421991629.〔学会発表〕1）栃木裕貴．WOREE 症候群モデルラットの中枢神経系における病理発生メカニズムの解明．第 68 回日本実験動物学会総会．2021 年 5 月 18 日．オンライン開催．2）泉水優志、池上亜実、栃木裕貴、片山健太郎、鈴木浩悦．WOREE 症候群モデルラットを用いた甲状腺ホルモン投与による治療効果の検討．第 164 回日本獣医学会学術集会．2021 年 9 月 7 日．オンライン開催．2． 犬の心臓血管外科手術における血液粘弾性検査を使用した凝固機能の評価研究代表者　獣医外科学研究室　　　　　　講師　鈴木周二研究実績の概要本研究は小動物臨床で実施される人工心肺装置を使用した心臓手術の術後管理において、従来実施されていた血小板機能検査と凝固能検査ではモニタリングが困難な病態に対して、トロンボエラストグラフィーを用いた全血による血液粘弾性検査が、心臓血管外科手術の術中および術後の血液凝固の状態をモニタリングする上で重要な役割を果たすことが可能かどうかを検討した。心臓外科手術では、人工心肺使用による血栓の防止のため、一般的に活性凝固時間（activated clotting time：ACT）が 400 秒を超えるまで、抗凝固薬であるヘパリンを投与した状態で実施するが、術後、凝固因子の希釈や拮抗後にも残存するヘパリンの影響により、微量な出血のコントロールに苦慮することが少なくない。今回実施した血液粘弾性検査により、心臓外科手術の際多くの症例で、プロタミンによるヘパリンの拮抗が不十分なことが判明した。また凝固因子の不足やヘパリンの残存、血小板の不足など、従来の検査よりも凝固不全の原因がより詳細に判明することとなった。その成果の一部を、犬でよく認められている先天性心疾患である肺動脈狭窄症の手術成績として、獣医麻酔外科学会で発表した。心拍動下で行う右室流出路再建術と血液粘弾性試験により、術後周術期の生存率において高い数値に繋がったと考えられる。さらなる改善の余地はあるが、本研究は安全に体外循環管理を実施するための礎となり、獣医心臓血管外科分野でのさらなる貢献につながると考えられる。今後、本研究結果を雑誌論文に投稿予定であり、また、僧帽弁閉鎖不全症をはじめとした、後天性心疾患においても、血液粘弾性試験の有用性を検討し、報告する予定である。研究発表〔雑誌論文〕1）Tanaka S, Shibuya H, Suzuki S, Kanno N, Harada Y, Sato A, Soeta S, Hara Y. Long-term administration of prednisolone: Effects on the myocardial tissue of healthy beagle dogs.J Vet Med Sci. 83(1). 2021. 84-93. 10.1292/jvms.20-0401. Epub 2020 Dec 2.日本獣医生命科学大学研究報告　第 71 号（2023）182）Tanaka S, Suzuki S, Sato A, Teshima T, Mori A, Sako T, Tanaka A, Hara Y. Utility of a corticotropin-releasing hormone test to differentiate pituitary-dependent hyperadrenocorticism from cortisol-producing adrenal tumors in dogs. J Vet Intern Med. 36(1). 2021. 29-38. 10.1111/jvim.16336. Epub 2021 Dec 3.〔学会発表〕1）鈴木周二．肺動脈狭窄症に対し人工心肺装置を使用した心拍動下右室流出路再建術を実施した犬 9 例．日本獣医麻酔外科学会．2022.3.19．オンライン開催．2）鈴木周二．猫のうっ血性心不全を考える ～フロセミド、ピ モ ベ ン ダ ン、 ＋α？～． 日 本 獣 医 麻 酔 外 科 学 会．2022.3.20．オンライン開催．3）鈴木周二．先天性心疾患の基礎 3．日本獣医循環器学会．2021.7.4．東京農工大学（オンラインハイブリッド開催）．4）鈴木周二．循環器疾患の救急医療．日本獣医循環器学会．2021.12.19．東京農工大学（オンラインハイブリッド開催）．3． 大腸菌における遺伝毒性物質コリバクチンの産生・分泌能の比較解析研究代表者　獣医学部獣医学科　　　　　　准教授　吉川悠子研究実績の概要本研究では、ヒトの大腸発がんに関与する可能性のあるコリバクチン産生大腸菌について、溶血性因子α - ヘモリシンのコリバクチン自体の産生・分泌への直接的影響を測る基礎的なデータの収集を目的とした。具体的には、ヒト大腸がん組織由来株と市販の食用ウシ腸管（いわゆるホルモン）由来株およびウシ糞便由来株（いずれも 4 株ずつ、計 12 株）の遺伝子型（ST: sequence type）の決定と培養細胞への感染によって観察される宿主細胞の表現型について、その程度を評価した。大腸菌の遺伝子型の決定は MLST 法にて行い、標的とする 7 遺伝子の部分的塩基配列の比較には、データベ ー ス (https://enterobase.warwick.ac.uk/species/ecoli/allele_st_search) を用いた。その結果、作成された系統樹にお い て、 ヒ ト 由 来 株 と ウ シ 由 来 株 は 大 腸 菌 の 基 準 株（JCM1649T）を挟んで大きく枝別れし、ヒト由来α - ヘモリシン保有株は同一のタイプに分類された。一方、ウシ糞便由来株の 3/4 が同じタイプに分類され、また、ウシ由来株では分離源の種類や原産国の違いで分岐群が分かれることはなかった。よって、ヒトとウシでは全く異なる系統のコリバクチン産生大腸菌を腸内細菌として保有していることがわかり、ヒトの場合、コリバクチン産生大腸菌は生後まもなく、保菌者である母体や周囲の人間から腸内細菌として定着する経路が考えられた。感染宿主細胞の表現型の程度の違いにおいては、α - ヘモリシンの有無による有意差は観察されず、ムチンなど腸管粘膜のバリア因子がない状態での解析では、α - ヘモリシンによる菌の腸管粘膜への定着優位性を正しく評価できないことが示唆された。以上、本研究にて、コリバクチン産生菌を大腸がんのリスクマーカーとしてがんの一次予防に役立てるうえで、一助となる成果が得られた。 研究発表〔雑誌論文〕1）Zhou, T., Hirayama, Y., Tsunematsu, Y., Suzuki, N., Tanaka, S., Uchiyama, N., Goda,Y., Yoshikawa, Y., Iwashita, Y., Sato, M., Miyoshi, N., Mutoh, M., Ishikawa, H., Sugimura, H., Wakabayashi, K. and Watanabe,K. Isolation of new colibactin metabolites from wild-type Escherichia coli and in situ trapping of a mature colibactin derivative. J. Am. Chem. Soc. 143. 2021. 5526-5533. 10.1021/jacs.1c01495.2）Tsunematsu, Y., Hosomi, K., Kunisawa J., Sato, M., Shibuya,N., Saito, E., Murakami H., Yoshikawa, Y., Ishikawa, H., Miyoshi, N., Mutoh, M., Ishikawa, H., Sugimura, H., Miyachi, M., Wakabayashi, K. and Watanabe, K. Mother-to-infant transmission of the carcinogenic colibactin-producing bacteria. BMC Microbiol. 21. 2021. 235. 10.1186/s12866-021-02292-1.4．RNA分解酵素T2は骨格筋再生機構に関わるのか？研究代表者　応用生命科学部動物科学科　　　　　　助教　倉岡睦季研究実績の概要骨格筋の委縮は、加齢、神経・筋疾患、悪性腫瘍にともなって生じ、筋力低下、生活動作の制限をもたらす重大な病態である。筋再生機構の解明は、医療・獣医療に関連した必須の研究課題である。骨格筋の再生は骨格筋線維の元になる筋芽細胞の増殖、筋分化によって進行する。筋組織に浸潤したM1/M2 マクロファージはこれに大きく関与し、炎症性のM1型は増殖に、抗炎症性のM2型は筋分化に促進作用を有している。本研究で着目したRNA分解酵素T2（RNaseT2）は、RNA分解の触媒作用とは別に、マクロファージの性質を変化させる生理活性が近年報告された。RNaseT2 は、M1型に対しては活性化、M2型には抑制の働きがあると考えられる。申請者は、マウス筋傷害・再生モデルの筋組織において、免疫組織化学的に浸潤マクロファージでの RNaseT2 発現を示唆する染色像を見出し、筋再生でのM1/M2 型分布に関与する可能性を考えた。そこで、同モデルの筋組織においてリコンビナント・マウス RNaseT2 の投与を実施し、定量的 PCR での発現因子のmRNAを解析した。筋傷害のみの対照群と比較して、筋傷害にRNaseT2 投与を加えた群では、M1型マーカーとなる炎症性サイトカインの有意な増加を認めた。M2型マーカーとなる抗炎症性サイトカインは、増加傾向はあるが有意差がみられなかった。また筋再生マーカーでは、RNaseT2 の投与条件によって有意な減少が認められた。以上の結果から、RNaseT2 の過剰発現は炎症を亢進し、筋再生を遅延させる可能性が示唆された。炎症・再生過程の2021 年度日本獣医生命科学大学若手研究者研究支援経費（研究成果報告書） 19時期によって、RNaseT2 は M1/M2 マクロファージを介した異なる働きを有する可能性があり、さらに解析が必要である。筋再生の有効な治療法と関連させて、RNaseT2 をターゲットにした創薬開発の可能性も視野に検討を行う。研究発表〔雑誌論文〕1）Kuraoka M, Aoki Y, Takeda S. Development of outcome measures according to dystrophic phenotypes in canine X-linked muscular dystrophy in Japan. Exp Anim. 70. 2021. 419-430. 10.1538/expanim.21-0072.

2021年度日本獣医生命科学大学若手研究者研究支援経費（研究成果報告書）

猪鼻, 真理

イノハナ, マリ

    Peptide nucleic acid–fluorescence in situ hybridization （PNA-FISH）により2種の飼育下サメ類より検出されたMycobacterium marinumによる生殖器抗酸菌症 （Genital mycobacteriosis caused by Mycobacterium marinum detected in two captive sharks by peptide nucleic acid–fluorescence in situ hybridization）      学位論文の内容の要約            日本獣医生命科学大学大学院獣医生命科学研究科 獣医学専攻博士課程令和1年入学  猪  鼻  真  理 （指導教授又は指導教員：和田 新平）     非結核性抗酸菌（Nontuberculous Mycobacteria、以下 NTM）とは結核菌 M. tuberculosis を代表とするM. tuberculosis complexとハンセン病の原因菌であるM. leprae を除く抗酸菌群を指し、魚類の NTM 症は 167 魚種以上の真骨類で報告され、多くの海水魚・汽水魚・淡水魚が罹患し、特に水族館では最も一般的な慢性疾患の一つである。原因菌としては M. marinum 並びに M. fortuitum、M. chelonae が最も一般的であり、皮膚潰瘍や内臓諸臓器の肉芽腫を特徴とする。魚類への健康障害に加えて、M. marinum は感染した魚の表面への曝露後に、ヒト、特に漁業従事者や魚類飼育関係者の皮膚に “Fish Granuloma”と呼ばれる肉芽腫性病変を生じ、肺炎の危険因子でもあることから、人獣共通感染症としての可能性が注目される。一方で、板鰓類における抗酸菌症の論文報告事例は国外で 5 例のみであり、真骨類に比べてその報告数は非常に少なく、国内での発生事例の報告はない。よって元来板鰓類の抗酸菌に対する感受性は低いと考えられてきた。  また、水圏とそれに関連するバイオフィルムが NTM の自然な生息地であり、魚類飼育環境からの NTM による汚染は臨床例における原因病原体の正確な検出において問題となりうる。そのため、魚類の抗酸菌症の組織標本の切片上で原因菌となる NTM種の遺伝子を局所的に確認できる診断ツールの開発が必要である。ペプチド核酸（PNA）蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）法は、抗酸菌のミコール酸を含む細胞壁を超えた菌体内への PNA プローブの拡散により、組織切片中の抗酸菌DNA の特定領域に PNAプローブを特異的に結合させることで、ヒトの臨床症例中の抗酸菌の検出に適用されている。しかし、現在魚類の抗酸菌感染症における特定の抗酸菌種を検出するための PNA-FISH法の報告はない。  そこで本研究では、板鰓類からヒトへの感染リスクを考慮し、国内の一水族館の同一水槽で飼育されていた板鰓類の剖検提出標本のうち抗酸菌症を疑うアカシュモクザメ Sphyrna lewini （症例 1）及びネコザメHeterodontus japonicus （症例 2）の2尾の病理組織学的解析、PNA-FISH法を含む分子生物学的解析、板鰓類由来抗酸菌種の同定を実施し、飼育下板鰓類臨床症例における抗酸菌症の病態の特徴および板鰓類に分布する抗酸菌種を検討し、ヒトおよび水棲生物の NTM の感染環や NTM 症の病態の解明の一助とすることを目的とした。   1.  病理学的検索  剖検時に鬱血や水腫などの非特異的病変が観察され、組織学的解析では両症例の生殖器（精巣及び卵巣）の結合組織において多数の抗酸性桿菌を貪食する類上皮細胞の集簇を伴う肉芽腫性炎を認めたが、中心部壊死や線維性被膜を伴う肉芽腫の形成は認められなかった。骨魚類の抗酸菌症の典型的病理像は肉眼像では小型〜大型の多発性白色結節の多発性病変を呈し、組織像では類上皮細胞ならびに線維性被膜に覆われ、抗酸性桿菌を含む中心部壊死巣を特徴とする乾酪壊死性肉芽腫が多発性に認められるが、今回板鰓類で観察された病態は真骨類で報告されている典型的抗酸菌症の病変とは異なる。また、真骨類において、発生は稀ではあるが生殖器の抗酸菌症が自然発生例および実験例ともに報告されており、肉芽腫性病変を形成することが知られている。板鰓類では現時点で生殖器の抗酸菌症の報告はなく、本研究から板鰓類においても抗酸菌が生殖器に病変を引き起こす可能性が示唆された。  2. 微生物学的検索  Middlebrook7H9液体培地及び Middlebrook7H11寒天培地、2%小川培地を用いて培養を行った結果、症例１精巣から 1 菌株（NJB1901）、症例 2 卵巣から 2 菌株（NJB19061及び 19062）の抗酸菌が分離され、いずれも Runyon分類（1959 年）により迅速発育菌（Runyon IV 群）に分類された。  3. 分子生物学的検索  分離菌株及びエタノール固定組織から DNA を抽出し、抗酸菌 house-keeping遺伝子（16S rRNA 遺伝子、65-kDa heat-shock protein-encoding（以下 hsp65）遺伝子、RNA polymerase β subunit遺伝子、superoxide dismutase A遺伝子）を標的としたPCR反応、ダイレクトシークエンス解析ならびに Basic Local Alignment Search Tool（以下、BLAST）塩基配列検索を行い、抗酸菌 house-keeping遺伝子の検出並びに部分塩基配列を決定した。さらに hsp65遺伝子のシークエンス結果から分子系統樹解析を実施した。BLAST塩基配列検索により、症例１精巣（Testis I）および症例２卵巣から抽出した DNA は M. marinum の hsp65遺伝子の部分塩基配列にのみ 100%の相同性を示し、症例 1 の分離株 NJB1901 並びに精巣組織の一部（Testis II）はMycolicibacterium llatzerense、症例 2 の分離株NJB19061 は M. hodreli、NJB19062は M. obuense の各 house-keeping遺伝子に高い相同性を示した。分子系統樹解析では各サンプルはそれぞれ BLAST塩基配列検索で近縁と考えられる菌種を含むクラスター内に分類され、95%以上のブートストラップ値で分岐した。一方、今回 M. marinum を同一クラスター内に含まれる他のマイコラクトン産生抗酸菌種と鑑別することを目的として、PCR反応により挿入配列 IS2404 および IS2606 の有無を検討し、両症例組織サンプルから抽出した DNA は IS2404 および IS2606 ともに陰性の結果を示した。以上の結果より、症例１精巣からは 2 菌種（M. marinum および M. llarzerense）が、症例 2 卵巣からは 3 菌種（M. marinum および M. obuense、M. hodleri）が検出され、本症例の抗酸菌症を引き起こした原因菌を確定するには、病理組織標本上で原因菌種の局在を確認する必要があった。  PNA-FISH法では、以上 4 菌種（M. marimnum及び M. hodleri、M. obuense、M. llatzerense）の 16S rRNA遺伝子の DNA部分塩基配列を対象とした PNAプローブ（15 bp）を作成し、M. marinum標準株 JCM17638 T及び ATCC BAA-535、並びに分離株 NJB1901及び NJB19061、NJB19062 を用いて PNA-FISH法を実施し、各プローブの特異性を確認した後、症例組織を用いて PNA-FISH 法を実施した。結果、M. marinum標的 PNAプローブを用いた PNA-FISH法により、病変部位の組織上で抗酸性桿菌の貪食が認められた肉芽腫性炎の部位に蛍光シグナルを観察することによりM. marinumのDNA部分塩基配列を検出し、病変部位におけるM. marinumの局在を明らかにした。   以上より、本 2 症例を M. marinum 感染による抗酸菌症と診断した。分離株NJB1901及び NJB19061、NJB19062 は死後または採材時に汚染された環境微生物であると判断し、PNA-FISH法がヒトと同様に魚類の抗酸菌症診断でも有用であると考えられる。本研究は板鰓類における M. marinum 感染症の初の報告であり、また、国内の板鰓類の抗酸菌症の発生報告事例 1 例目となる。「One Health」の考え方に基づき、ヒトへの NTM 感染を抑制するためには水域環境や水棲生物における NTM の有病率や分布を知ることが重要である。しかし、現段階では板鰓類における抗酸菌症に関する情報の不足から、板鰓類の抗酸菌に対する感受性や板鰓類からのヒトへの感染の可能性は明らかではないが、本研究では板鰓類が M. marinum の宿主になることが示された。また、本症例では真骨類では感染が稀な生殖器に抗酸菌感染による乾酪壊死巣を伴わない肉芽腫性炎が観察されたことから、板鰓類では真骨類とは病理学的特徴が異なり、診断を困難とし、真骨類と比べて一部の症例しか報告されていない可能性が考慮される。よって、真骨類とは異なる肉眼および組織像でも板鰓類では抗酸菌症を類症鑑別として疑う必要があり、飼育下板鰓類における人獣共通感染症の原因菌の候補として考慮されるべきである。このことから今後この板鰓類に関連するNTM と水生環境の関係についてのデータ不足を解消するために板鰓類を積極的な調査対象とする必要があると結論づけられる。  

Peptide Nucleic Acid–Fluorescence In Situ Hybridization (PNA-FISH)により2種の飼育下サメ類より検出されたMycobacterium marinumによる生殖器抗酸菌症

日本獣医生命科学大学博士（獣医保健看護学）令和4年度technical repor

清水, 夕貴

シミズ, ユキ

全身麻酔下での磁気共鳴画像検査における犬の周麻酔期体温管理

2021 年度大学間連携等による共同研究に係る研究成果報告書（麻布大学）

荒木, 真美

アラキ, マミ

        イヌ乳腺腫瘍における 受容体型 Tumor endothelial marker 8 (TEM8RT)の発現と 腫瘍細胞の分化に対する作用に関する研究 (Receptor type tumor endothelial marker 8 (TEM8RT) expression and its roles in cellular differentiation in canine mammary gland tumors)      学位論文の内容の要旨            日本獣医生命科学大学大学院獣医生命科学研究科 獣医学専攻博士課程平成 31年入学  荒  木  真  美 （指導教授又は指導教員：横須賀 誠）     イヌ乳腺癌（CMGCs）において、腫瘍細胞の分化状態は腫瘍の生物学的動態や臨床成績に関連していると考えられているが、腫瘍細胞の分化を制御しているメカニズムについては不明な点が多い。受容体型Tumour endothelial marker 8（TEM8RT）とそのリガンドであるエンドトロフィン（ETP）は、乳腺癌のstem cellsを維持することによって、腫瘍細胞の分化を制御していることが明らかとなっている。しかしながら、TEM8RTやETPを発現する乳腺腫瘍細胞の性状や、各分化段階の乳腺管腔上皮細胞様の腫瘍細胞における機能はわかっていない。本研究では、CMGCsにおいて、TEM8RTやETPを発現する腫瘍細胞の性状と、管腔上皮系細胞様腫瘍細胞の分化に対するTEM8RTの役割を明らかにすることを目的とする。139例のCMGCsにおいて、TEM8RTとETPの前駆体であるCOL6a3は、CK19+/CK5+あるいはCK19+/CD49f+の管腔上皮前駆細胞様の腫瘍細胞に有意に発現することを明らかにした。さらにTEM8RTとCOL6a3は組織学的に低悪性度の腫瘍に有意に共発現しており、TEM8RTとETPによるオートクラインあるいはパラクラインシグナリングが腫瘍の低悪性度と関連している可能性が示唆された。また、TEM8RT遺伝子ノックダウンを行ったstem/bipotent progenitor様および管腔上皮前駆細胞様のイヌ乳腺癌細胞株において管腔上皮細胞の分化調節因子の発現を検索した結果、TEM8RTはstem/bipotent progenitor様腫瘍細胞では管腔上皮前駆細胞様腫瘍細胞への分化を促進し、管腔上皮前駆細胞様腫瘍細胞では管腔上皮前駆細胞様の形質を維持することが示唆された。さらに、TEM8RT遺伝子ノックダウンとTEM8RT遺伝子過剰発現を施したstem/bipotent progenitor様および管腔上皮前駆細胞様腫瘍細胞におけるシスプラチンの抗腫瘍作用を検索した結果、TEM8RTはstem/bipotent progenitor様腫瘍細胞のシスプラチンの感受性を低下させることが示唆された。以上の結果、CMGCsにおいては、TEM8RTは管腔上皮前駆細胞様の形質の発現を促進あるいは保持することによって、低悪性度の腫瘍細胞を維持している可能性が示唆された。              Receptor type tumor endothelial marker 8 (TEM8RT) expression and its roles in cellular differentiation in canine mammary gland tumors      Abstract          Mami Araki        Graduate School of Veterinary Medicine and Life Science  Nippon Veterinary and Life Science University      

Not a member yet

生命科学総合研究センター紀要第2巻