Abstract
The delta opioid receptor (δOR) is a member of the G protein-coupled receptor family. This transmembrane receptor has an important role in the regulation of pain. The OPRD1 gene that encodes the human δOR (hδOR) contains at least 11 single-nucleotide polymorphisms (SNPs). The only nonsynonymous SNP resides in the amino-terminal (N-terminal) domain of the receptor and it replaces Phe at position 27 with Cys, thus introducing an unpaired Cys residue on the extracellular surface of the receptor. The Cys27 variant has been shown to have an allelic frequency of about 10% in Caucasian populations. The polymorphic site is flanked by two putative N-glycosylation sites at Asn18 and Asn33. In this study, the folding, maturation and trafficking of hδOR was assessed using the hδORPhe27 and hδORCys27 variants and the N-glycosylation deficient forms of the latter as models in a heterologous expression system. The effects of N-glycosylation and the unpaired Cys-residue were studied with various biochemical, pharmacological and cell biological methods. In addition, protein-protein interactions of the intracellular hδOR precursors were assessed.
The hδORCys27 and hδORPhe27 variants differed significantly in their subcellular localization and maturation efficiency. The newly synthesized hδORCys27 was found to accumulate in the endoplasmic reticulum (ER) prior to its ER-associated degradation in proteasomes. Although a slow maturation rate was characteristic for both variants, only the hδORCys27 had poor maturation efficiency. The cell surface expression of hδORCys27 was further decreased because the constitutive internalization of this receptor was enhanced compared to hδORPhe27.
N-linked glycosylation was not required for hδOR function or ligand binding, but was important for the expression of the correctly folded receptor species at the cell surface. The mutant non-N-glycosylated receptor was shown to traffic to the cell surface with enhanced kinetics, but some of the plasma membrane receptors were in a nonnative conformation. Also, the overall levels of the non-N-glycosylated hδORCys27 were decreased as the receptor was efficiently internalized for lysosomal degradation in a constitutive fashion.
The hδORCys27 and hδORPhe27 precursors were found to interact with several ER localized proteins, such as calnexin (CNX), protein disulfide isomerase (PDI) and ERp72. The receptors also associated with the sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase 2b (SERCA2b), which was shown to occur during translocation of the receptor to the ER membrane or immediately thereafter. The interaction was not receptor N-glycan dependent and the normal functional activity of SERCA2b was shown to be required for proper cell surface expression of hδOR.Tiivistelmä
δ-opioidireseptori kuuluu G-proteiinikytkentäisiin reseptoreihin, ja sillä on tärkeä rooli kivun säätelyssä. Ihmisen δ-opioidireseptoria koodaavassa OPRD1 geenissä on havaittu ainakin 11 yhden nukleotidin polymorfiaa. Vain yksi tunnetuista polymorfioista aiheuttaa muutoksen proteiinin aminohapposekvenssiin. Se sijaitsee reseptorin aminoterminaalisessa osassa ja se muuttaa fenyylialaniinin (Phe) kohdassa 27 kysteiiniksi (Cys), joka on pariton. Cys27-variantin yleisyys eurooppalaisessa väestössä on noin 10 %. Polymorfisen kohdan molemmilla puolilla on N-glykosylaatiokohdat asparagiineissa Asn18 ja Asn33.
Tämän työn tavoitteena oli tutkia δ-opioidireseptorin laskostumista, maturaatiota ja kuljetusta heterologisessa solumallissa käyttämällä Phe27- ja Cys27-variantteja sekä Cys27-variantin N-glykosyloimatonta mutanttia. Cys27-polymorfian ja N-glykosylaation vaikutuksia tutkittiin useilla biokemiallisilla, farmakologisilla sekä solubiologisilla menetelmillä. Lisäksi työssä tutkittiin solunsisäisen δ-opioidireseptorin esiasteen vuorovaikutusta muiden proteiinien kanssa.
Phe27- ja Cys27-varianttien sijainti solun sisällä ja maturaatiotehokkuus eroavat toisistaan merkittävästi. Vastasyntetisoitu Cys27-variantti kerääntyy endoplasmakalvostoon, josta se ohjautuu proteasomihajoitukseen. Molemmat variantit kulkeutuvat solun pintaan hitaasti. Cys27-variantin prosessointi on huomattavasti tehottomampaa ja sen määrää solun pinnalla vähentää myös lisääntynyt ohjaaminen solunsisäiseen lysosomihajotukseen.
N-glykosylaatiolla ei havaittu olevan vaikutusta reseptorin toimintaan tai ligandin sitomiseen, mutta sillä on tärkeä merkitys oikein laskostuneiden reseptorien kuljetukselle solun pinnalle, koska osa pintaan päässeistä N-glykosyloimattomista reseptoreista on muodossa, johon reseptorispesifinen ligandi ei sitoudu. Vaikka mutanttireseptori kulkeutuukin solun pintaan nopeammin, sen määrä solun pinnalla on alhaisempi, koska mutanttireseptori ohjataan huomattavan nopeasti solun pinnalta lysosomihajotukseen.
Phe27- ja Cys27-varianttien havaittiin olevan myös vuorovaikutuksessa eräiden endosomaalisen kalvoston proteiinien kanssa, kuten kalneksiinin, proteiinidisulfidi-isomeraasin ja ERp72-proteiinin. Kumpikin reseptori havaittiin yhteisessä rakenteessa sarko(endo)plasmakalvoston kalsium-ATPaasi 2b -pumpun (SERCA2b) kanssa N-glykosylaatiosta riippumattomalla tavalla. Nämä proteiiniryhmät muodostuvat, kun reseptori liitetään synteesin aikana endoplasmakalvostoon tai heti sen jälkeen. Vuorovaikutus toiminnallisen SERCA2b:n kanssa havaittiin tärkeäksi toimintakykyisen δ-opioidireseptorin esiintymiselle solun pinnassa
