Monastrell grape polyphenol oxidase was purified, showing both activity towards monophenols and o-diphenols. The kinetic parameters, Km and optimal temperature, were evaluated in both activities. Cresolase activity presents a particular lag period, which may be modified by the temperature, enzyme concentration, the presence of o-diphenols and substrate concentration.La enzima polifenol oxidasa ha sido purificada a partir de uva Monastrell mostrando actividad tanto en la oxidación de monofenoles (cresolasa) como en la de o-difenoles (catecolasa). Los parámetros cinéticos, Km y temperatura óptima, han sido evaluados en ambas actividades. La actividad cresolasa presenta un período de retardo característico, que puede ser modificado por la temperatura, la concentración de enzima, la presencia de o-difenoles y la concentración de sustrato

Bru, R.

Cabanes, J.

Sánchez-Ferrer, A.

Spanish

Revistas Científicas de la Universidad de Murcia

ANALES DE BIOLOGÍA, 14 (Biología General, 3). 1987: 7-11 SECRETARIADO DE PUBLICACIONES - UNIVERSIDAD DE MURCIA CINÉTICA DE HIDROXILACI~N Y OXIDACI~N DE COMPUESTOS FEN~LICOS POR POLIFENOL OXIDASA DE UVA MONASTRELL (VITIS VINIFERA) A. SánchezcFerrer*, R. Bru* y J. Cabanes* Recibido: octubre 1987 Aceptado: marzo 1988 Publicado: febrero 1989 SUMMARY Kinetics of hydroxilation and oxidation of phenolic compounds by Monastrell grape (Vitis vinifera) Polyphenol Oxidase Monastrell grape polyphenol oxidase was purified, showing both activity towards monophenols and o-diphenols. The kinetic parameters, Km and optimal temperature, were evaluated in both activities. Cresolase activity presents a particular lag period, which may be modified by the temperature, enzyme concentration, the presence of o-diphenols and substrate concentration. Key words: grape, polyphenol oxidase, kinetic, phenols. RESUMEN La enzima polifenol oxidasa ha sido purificada a partir de uva Monastrell mostrando actividad tanto en la oxidación de monofenoles (cresolasa) como en la de o-difenoles (catecolasa). Los parámetros cinéticos, Km y temperatura óptima, han sido evaluados en ambas actividades. La actividad cresolasa presenta un período de retardo característico, que puede ser modificado por la temperatura, la concentración de enzima, la presencia de o-difenoles y la concentración de sustrato. Palabras clave: uva, polifenol oxidasa, cinética, fenoles. Las  reacciones de  oxidación asociadas con el oscurecimiento de los tejidos dañados de  frutos frescos y végetales están catalizadas por la en- zima polifenoloxidasa (EC 1.14.18.1) (PPO). Esta enzima está probablemente presente en todas las plantas (WHITAKER, 1972), pero su actividad es  particularmente alta e n  aquellos frutos y vegetales que contienen niveles signifi- cativos de  compuestos fenólicos, como es  el caso de  la uva, donde el enzima, usando el oxí- geno molecular del aire, es  capaz de  catalizar la o-hidroxilación de monofenoles (como el p-cre- sol) a o-difenoles (como 4-metil catecol), activi- dad cresolasa, y su posterior oxidación a o- quinonas, actividad catecolasa. Las quinonas así formadas evolucionan por polimerización espontánea originando pigmentos coloreados. Estos procesos causan un cambio radical en el color, aroma y sabor del vino, con la consi- guiente pérdida de  calidad, provocando impor- tantes pérdidas económicas en la industria del vino. Esta importancia económica ha impulsado un gran número de  investigaciones sobre PPO de uva insistiendo sobre: su localización subcelu- lar (IVANOV, 1967), el mecanismo de reacción (LERNER & MAYER, 1976), la variación de  la actividad enzimática durante la maduración de la uva y la producción del vino (WISSEMANN & LEE, 1980; SAPIS et  al., 1983) y la especifi- * Dep. de Bioquímica. Fac. de Biología. Universidad de Murcia. E-30001 Murcia. cidad del enzima por diferentes o-difenoles (HAREL & MAYER, 1971). Sin embargo, la bibliografía revela que las ca- racterísticas obtenidas para las variedades de uvas americanas e israelitas no pueden ser sis- tematizadas para las variedades europeas, e in- cluso dentro de un mismo país estas caracterís- ticas vanan de una región a otra y de una varie- dad a otra. El propósito del presente trabajo, es  realizar un estudio cinético de la PPO parcialmente pu- rificada de uva Monastrell procedente de  Jumi- Ila (Murcia), como paso previo para intentar abordar las posibles relaciones de esta actividad con los problemas de  oxidación característicos que presenta el vino tinto de  la zona. MATERIALES Y MÉTODOS PURIFICACI~N DEL ENZIMA Las uvas Monastrell (Vitis vinifera L.) fueron re- colectadas en estado de maduración y libres de hon- gos en Jumilla, Murcia (España), llevadas al laborato- rio en hielo y congeladas a -20" C. El enzima fue extraído haciendo una modificación al método de LERNER et al. (1972). 200 gramos de uva desconge- lados en 100 m1 de tampón fosfato 100 mM pH 7.3 conteniendo ascorbato sódico 10 mM, fueron homo- geneizados durante 15 segundos con una trituradora de aspas, filtrados a través de 8 capas de gasa y cen- trifugados a 4000 x g durante 15 minutos. El preci- pitado fue extraído durante 6 horas con Titron X-100 al 1.5% y con polivinilpirrolidona insoluble (PVP) al 2%. Posteriormente fue centrifuaado a 15000 x a du- rante 1 hora. El sobrenadante &e sbmetido a preci- pitación con sulfato amónico entre el 45 y el 95% de saturación a 4" C. El precipitado fue resuspendido en agua destilada y tras diálisis fue utilizado como fuente de enzima. Las concentraciones de proteínas fueron medidas siguiendo el método de LOWRY et al. (1951) después de precipitar los fenoles con PVP. ENSAYOS ENZIMATICOS Tanto la actividad cresolasa sobre p-creso1 como la catecolasa sobre 4-metil catecol han sido medidas es- pectrofotométricamente por la aparición de la 4-me- tile-benzoquinona a 400 nm (E = 1350 M-' cm-'), a sus respectivos pHs óptimos de 7.0 y de 5.0. Una unidad enzimática fue definida como la canti- dad de enzima que produce l pmol de Cmetile-ben- zoquinona por minuto, usando 4-metil catecol 30 mM en tampón acetato 10 mM pH 5.0 a 30" C. RESULTADOS Y DISCUSIÓN L a  PPO de  uva Monastrell fue purificada 126 veces siguiendo una modificación del método de LERNER et al. (1972) y obteniendo una re- cuperación del 70%. L a  PPO parcialmente purificada presenta tanto actividad catecolasa (fig. 1, a )  como cre- solasa (fig. 1, b), con pHs óptimos de 5.0 y 7.0, respectivamente. Esta última actividad se ca- racteriza por un período de  retardo (L) en la aparición de la actividad enzimática. Este pe- ríodo de retardo se define como la intersección con el eje de abcisas de la prolongación de la zona lineal de la curva de acumulación de pro- ducto. L a  velocidad de  estado estacionario es  evaluada por estimación de la pendiente de di- cha zona lineal. 5 t min 1 O FIGURA l .  Actividades enzimáticas de PPO de uva Monastrell. (a) Actividad catecolasa. El medio de reacción a 30" C contiene, en un volumen final de 2.5 ml: 0.75 pg/ml de PPO y 4-metil catecol 30 mM en tampón acetato 10 mM pH 5.0. (b) Actividad cre- solasa. El medio de reacción a 30" C contiene en un volumen final de 1 ml: 0.5 mM p-creso1 en tampón fosfato 10 mM pH 7.0 y 480 pg/ml de PPO parcial- mente purificada. Enzymatic activities of Monastrell grape PPO. (a) Catecholase activity. The reaction mixture al 30' C included, in a total volume of 2.5 rnl: 0.75 pgiml of PPO and 30 mM 4-rnethyl catechol in 10 mM acetate buffer al pH 5.0. (b) Cresolase activity. The reaction rnedium al 30" C contained in a final volume of 1 ml: (b) 0.5 mM p-creso1 in 10 rnM phosphate buffer pH 7.0 and 480 pgiml of panially purified PPO. El efecto de la temperatura sobre la expre- sión de la actividad catecolasa de  PPO se  muestra en la figura 2, a.  La temperatura óp- tima del enzima para esta actividad se  encontró en el rango entre 25 y 40" C con un ligero des- censo a mayores temperaturas. Esta resistencia a altas temperaturas es  una característica de  CINÉTICA DE POLIFENOL OXIDASA DE UVA 9 PPO de uva Monastrell, ya que en general el resto de las PPOs de uva estudiadas tienen su rango de temperatura entre 25 y 30" C (NA- KAMURA et al., 1983; CASH et al . ,  1976). l I 1 I 1 1 20 30 40 50 60 Temperatura ( " C )  FIGURA 2. (a) Efecto de la temperatura sobre la ac- tividad catecolasa de PPO de uva Monastrell. El me- dio de reacción a diferentes temperaturas contiene en un volumen total de 2.5 ml: 5 pgíml de PPO parcial- mente purificada y 4-metil catecol 30 mM en tampón acetato 10 mM pH 5.0. (b) Representación de Ha- nes. El medio de reacción a 30" C contiene: 5 pgíml de PPO parcialmente purificada y 4-metil catecol en- tre 2-50 mM en tampón acetato 10 mM pH 5.0. (a) EfYect of temperature on the catecholase activity of Monasti-el1 grape PPO. The reaction mixture at ditl'erent temperatui-es included in a total volume ot 2.5 ml: 5 pgiml of partially purified PPO and 30 m M  4-methyl catechol in a 10 m M  acetate butfer, at p H  5.0 (h)  Hanes plot. The reaction mixture at 30" C included: 5 pg/ml of PPO partially puri- fied PPO and 4-methyl catechol in a i-ange between 2-50 m M  in a 10 m M  acetate buffer. at p H  5.0. La Km aparente para 4-metil catecol fue evaluada mediante la representación de Hanes, obteniendo un valor de 9 mM (fig. 2, b). Dicha Km es un valor intermedio entre los valores descritos para otras PPOs de  uva (3 mM - 24 mM) (LERNER & MAYER, 1976; HAREL & MAYER, 1971) y muy alta cuando se compara con los valores obtenidos con enzimas de champiñón y bacterias. HIDROXILACI~N DE MONOFENOLES En la figura 3 se muestra la dependencia de la actividad cresolasa con la temperatura obser- vando una curva ligeramente sesgada hacia un rango de temperatura óptima entre 40-60" C. En la misma figura se  muestra el efecto de la temperatura sobre el período de retardo carac- tenstico de la actividad cresolasa, apareciendo un marcado descenso en el período de retardo al aumentar la temperatura. Cuando se comparan la figura 2, a y la figura 3 se puede destacar el hecho de que cada una de las dos actividades tiene una temperatura óptima distinta a pesar de estar situadas ambas en un mismo centro activo. 20 30 40 50 60 Temperatura ( " C )  FIGURA 3. Efecto de la temperatura sobre la activi- dad cresolasa de PPO de uva Monastrell ( --- O). El medio de reacción a diferentes temperaturas inclu- yen un volumen final de 1 ml: 480 pglml de PPO par- cialmente purificada y p-creso1 0.5 rnM en tampón fosfato 10 mM pH 7.0. Influencia de la temperatura sobre el período de retardo de la actividad cresolada ( O  --- O )  bajo las mismas condiciones. Effect of temperature on the creiolase activity of Monastrell grape PPO (0 --- ). The reaction medium at different temperatures included, in a total volume ot I mI: 480 pg/ml of partially purified PPO and 0.5 m M  p-creso1 in a 10 m M  phoaphate buffer. at p H  7.0. Lnfluence of tempe- rature on the lag period ot creiolase activity (O --- O)  under the same conditions. El período de retardo se vio afectado por la concentración de enzima, así al aumentar dicha concentración en un rango de 120 - 1200 pglml, el período de retardo disminuía desde 18 hasta 3 minutos (fig. 4). Como se ha indicado antes, tanto el aumento de la temperatura como el aumento en la con- centración de enzima son capaces de disminuir el período de  retardo, lo cual sugiere que el período de retardo es  consecuencia de la activi- dad cresolasa expresada en el medio de  reac- ción más que de la concentración de enzima presente en él. Para examinar esta posibilidad los resultados obtenidos en la figura 3 (excepto los dos valores de alta temperatura, donde hay termoinactivación) fueron redibujados en fun- ción de la actividad cresolasa expresada (fig. 4), observando una similitud con la gráfica obtei 15 L min 10 5 con la concentración de o-difenoles en el medio de reacción: 1 1 1 [o-difenol] - +-  (1) L 1 1 Kac1 Donde L, 1 y K,,, representan, respectiva- mente, el período de retardo en presencia y au- sencia de o-difenol y la constante de activación para el o-difenol. La K,,, puede interpretarse como la constante de afinidad del o-difenol por el centro de activación. La figura 5, a repre- senta el efecto de la concentración de 4-metil catecol sobre el período de retardo. El cálculo de la K,,, se obtiene de la representación de la figura 5, b; evaluándose en 1.6 1M. Dicha K,,, es relativamente alta cuando se compara con otras PPOs (LERCH & ETTLINGER, 1972) y muy pequeña cuando se compara con la Km aparente para el 4-metil catecol. FIGURA 4. Dependencia del período de retardo con la concentración del enzima. El medio de reacción a 30" C incluye en un volumen final de 1 ml: enzima en un rango entre 120-1200 pdml de PPO parcialmente purificada y p-creso1 0.5 mM en tampón fosfato 10 mM pH 7.0 (@ --- a). La dependencia del pe- nodo de retardo de la actividad cresolasa expresado en función de la temperatura es mostrado por (O --- O). Las condiciones son las mismas que en la figura 3. Dependence of lag period with enzyme concentration. The reaction- mixture at 30" C included in a final volume of I ml: enzyme in a range between 120-1200 pg/ml o f  pamally purified PPO and 0.5 mM p-creso1 in 10 mM phosphate buffer, at pH 7 .0  (e ---e). The dependence of the lag period with cresolase activity expressed in the reaction medium as funclion of temperalure is shown by (O --- O). The conditions are the same as  fig. 3. nida al aumentar la concentración de enzima, por tanto el período de retardo debe ser corre- lacionado con el aumento en la actividad enzi- mática: tanto si ésta se expresa por un incre- mento en la concentración de enzima como si se debe a la activación del enzima al incremen- tar la temperatura. Es un hecho bien documentado que el pe- ríodo de retardo de la actividad cresolasa puede ser acortado o eliminado por la adición de agentes reductores y o-difenoles; actuando es- tos últimos como co-sustratos (GARCIA CAR- MONA et al.,  1979; DUCKWORTH & COLE- MAN, 1970). Esto ha sido interpretado en la bibliografía asumiendo un centro de activiación para los o-difenoles (POMERANTZ & WAR- NER, 1967), estableciendo la siguiente ecuación empírica para relacionar el período de retardo [4 MCI pM FIGURA 5. Influencia del 4-metil catecol sobre el pe- nodo de retardo. El medio de reacción a 30" C in- cluye en un volumen final de 1 ml: 480 pg/ml de PPO parcialmente purificada, p-creso1 0.5 mM y Cmetil catecol (0-24 pMj en tampón fosfato 10 mM pH 7.0. La gráfica insertada muestra los mismos resultados utilizando la ecuación (1) para calcular la K,,,. lntluence of Cmethyl catechol on the lag period. The reaclion medium at 30" C contained in a final volume of I ml: 480 pdml  of partially purified PPO, 0 .5  mM p-creso1 and Cmelhyl catechol (0-24 IiM) in 10 mM phosphate buffer, a l  pH 7.0. lnset graph shows the same results plotted according to equation (1) for calculating the K,,,. Cuando se estudió el efecto de la concentra- ción de p-creso1 sobre la actividad cresolasa en un rango entre 0.25-2 mM, se observó que el CINÉTICA DE POLIFENOL OXIDASA DE UVA 11 período de  retardo aumentaba al aumentar  la concentración de  sustrato (fig. 6, a). a L min 6 a FIGURA 6. (a) Efecto de la concentración de subs- trato sobre la actividad cresolasa de PPO. El medio de reacción a 30" C contiene, en un volumen total de 1 ml: 480 pg/ml de PPO parcialmente purificada y p-creso1 en un rango entre 0-2 mM en tampón fosfato 10 mM pH 7.0 (e --- O). La influencia de la con- centración de substrato sobre el período de retardo bajo las mismas condiciones ( O  --- O ) .  (b) La grá- fica insertada muestra la representación de Hanes para evaluar la Km aparente sobre el p-creso]. (a) Effect of substrate concentration on cresolase activity of PPO. The reaction mixture at 30" C included, in a total volume of 1 ml: 480 wgiml of parlially puritied PPO and p-creso1 in a range between 0-2 mM in 10 mM phosphate buffer, at p H  7.0 ( 0  - - - O ) .  The intluence of substrate concentration on the lag period under the same conditions i O --- 0). (b) The inset graph shows the H a y s  plot for evaluating the appdrent Km for p-cresol. L a  K m  aparente para p-creso1 fue evaluada mediante la representación d e  Hanes  (fig. 6, b), obteniendo un valor d e  0.5 mM. Este  resultado no puede ser comparado con la bibliografía, de- bido a que la K m  para  la actividad cresolasa d e  otras PPOs d e  uva n o  ha sido descrita,  ya  q u e  en general s e  ha negado la existencia de  activi- dad cresolasa e n  PPO de  uva (NAKAMURA e t  al., 1983). Esta  falta de  actividad cresolasa ha sido explicada po r  la pérdida d e  dicha actividad durante la extracción y purificación del enzima, aunque los resultados de  este trabajo parecen indicar que  más  que  una pérdida real d e  la acti- vidad, lo que  puede ocurrir e s  un enmascara- miento d e  la actividad por  la pérdida d e  fenoles durante los pasos d e  purificación, lo que  pro- voca un aumento importante e n  los períodos d e  retardo. una ayuda de la Comisión Asesora de Investigación Científica y Técnica (Proyecto PA85-0271). A. Sán- chez Ferrer es becario del Plan de Formación del Personal Investigador del Ministerio de Educación y Ciencia. R. Bru es becario de la Comunidad Autó- noma de Murcia (Biotecnología). Agradecemos a M. J. Sánchez Contreras su colaboración técnica. Agra- decemos a bodegas Umbría la donación de las mues- tras utilizadas en este estudio. CASH, J. N.; SISTRUNK, W. A. & STUTTE, C. A. 1976. Characteristics of Concord grape polyphenoloxi- dase involved in iuice color loss. J. Food Sci.. 41: 1.398-1.402. DUCKWORTH. H. W. & COLEMAN. J. E. 1970. Phvsi- cochemical and kinetic properties of mushriom tyrosinase. J. Biol. Chem.,  245: 1.613-1.625. GARC~A-CARMONA, F.;  PEDRENO, E.; GALINDO, J. D. & GARCIA-CÁNOVAS, F. 1979. A new spectropho- tometric method for the determination of creso- lase activity of epidermis tyrosinase. Anal. Bio- chem., 95: 433-435. IVANOV, T. 1967. Sur I'oxydation du moGt de raisin 1. Activité de lapolyphénoloxydase du raisin des céspages aMuscat Rouge», *Dimiat», «Riesling» et .Aligote.. Ann. Technol. Agric., 16: 35-39. HAREL, E. & MAYER, A. M. 1971. Partial purification and properties of catechol oxidases in grapes. Phytochernistry, 10: 17-22. LERCH, K. & ETTLINGER, L. 1972. Purification and characterization of a tyrosinase from Streptomy- ces glaucescens. Eur. J .  Biochem, 31: 427-437. LERNER, H. R.; MAYER, A. M. & HAREL, E. 1972. Evidence for conformational changes in grape ca- techo1 oxidase. Phytochemistry, 1 l :  2.415-2.421. LERNER, H. R. & MAYER, A. M. 1976. Reaction me- chanism of grape catechol oxidase: A Kinetic study. Phytochemistry, 15: 57-60. LOWRY, O. H.; ROSEBROUH, N.  J.; FARR, A. L. & RANDALL, R. J. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem.,  193: 265- 1°C L I J .  NAKAMURA, K.; AMANO, Y. & KAGAMI, M. 1983. Pu- rification and some properties of a polyphenol oxidase from Koshu grapes. Am. J. Enol. Vitic., 34: 122-127. POMERANTZ, S. H. & WARNER, M. C. 1967. 3, 4- Dihydroxy-L-phenylalanine as the tyrosinase co- factor. J. Biol. Chem., 242: 5.308-5.314. SAPIS, J. C.; MACHEIX, J. J. & CORDONNIER, R. E. 1983. The browning capacity of grapes. l .  Chan- ges in polyphenol oxidase activities during deve- lopment and maturation of the fruit. J. Agric. Food Chem., 31: 342-345. WHITAKER, J. R. 1972. Principies of enzymology for rhe food sciences. Marcel Dekker. Inc. New ~ o r k .  AGRADECIMIENTOS WISSEMANN, K. W. & LEE, C. Y. 1980. Polyphenolo- xidase activity during grape maturation and wine Este trabajo ha sido parcialmente financiado por production. Am. J. Enol. Vitic., 31: 206-21 1. 

CINÉTICA DE HIDROXILACIÓN Y OXIDACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS POR POLIFENOL OXIDASA DE UVA MONASTRELL (VITIS VINIFERA)

https://revistas.um.es/analesbio/article/download/34801/33331

CINÉTICA DE HIDROXILACIÓN Y OXIDACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS POR POLIFENOL OXIDASA DE UVA MONASTRELL (VITIS VINIFERA)

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Revistas Científicas de la Universidad de Murcia