Employment of whole genome resequencing to reveal the evolutionary history and to develop molecular tools for Western European honey bees (Apis mellifera subspecies)
Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental (Especialidade em Evolução, Biodiversidade e Ecologia)The Western honey bee, Apis mellifera L., acts as a pollinator, thus playing a role in the
ecosystem of paramount importance. However, the genetic integrity of many subspecies has
been threatened by introgressive hybridization. In an attempt to reverse this trend, the main goals
of this dissertation were (i) to reveal the genetic structure of one of the most complex and diverse
subspecies in Europe, the Iberian honey bee (Apis mellifera iberiensis), and (ii) to develop
molecular tools for the Iberian honey bee and its sister subspecies, the Dark honey bee (Apis
mellifera mellifera), both belonging to the western European lineage M. These molecular tools
can be employed for breeding and conservation programs in western and southern Europe.
The Dark honey bee A. m. mellifera has been severely threatened by hybridization with
subspecies of eastern European (C lineage) ancestry, such as A. m. ligustica and A. m. carnica.
Using 113 haploid honey bees collected from eight countries and genotyped with 1183 SNPs
with the GoldenGate® Assay, five panels containing 48, 96, 144, 192 and 384 ancestry
informative SNPs (fitted to the plexes of GoldenGate® Assays) were designed to estimate
admixture proportions of C-lineage into A. m. mellifera. All SNP panels were able to estimate Clineage
admixture proportions highly concordant with those inferred from the 1183 SNP dataset
(r≥0.997).
The discontinuation of Illumina’s GoldenGate® Assay and the need of a standard method
to examine the purity of honey bee populations in a wide geographical area were the motivation
to design four multiplexed SNP assays to be genotyped using the iPLEX MassARRAY system,
having as a baseline the 144-plex SNP panel. An accurate and cost-effective tool was provided
with all genomic information for 117 SNPs for immediate application in genetic surveys and
conservation management of A. m. mellifera. The performance of the assays was assessed
against the data from 27 Whole-Genome (WG) sequences and using a set of individuals obtained
from controlled crosses. In addition, sensitivity tests indicate that this genotyping system has the
potential to detect C-lineage introgression at a low frequency (diluted as 1:20 in DNA pools or as
1 F1 hybrid: 7 A. m. mellifera individuals in tissue pools).
In contrast with A. m. mellifera, A. m. iberiensis populations exhibit a preserved complex
genetic variation pattern. Although neutral processes have played an important role in shaping
the Iberian diversity pattern, selection should not be ignored. Therefore, the WGS data of 87
Iberian honey bees were scanned for selection signals using three methods (Samβada, LFMM
and PCAdapt) and two datasets (genomic and environmental). Candidate SNPs detected by at least two methods were further examined using a haplotype-based method and protein
modelling. Among the 830 SNPs exhibiting selection signals, 90.2% lie in non-coding regions,
suggesting that regulatory changes are important in local adaptation. An enrichment of nonsynonymous
SNPs was also found, three of them leading to amino acid replacements, within or
in the close vicinity of a functionally important site of proteins with functions related to lipids and
transmembrane transport. Using both genetic and environmental data, candidate genes
putatively under climate-driven adaptation were identified. Interestingly, membrane-related and
circadian clock genes, which allow the organism to sense and fine-tune with environmental
oscillations, are among the strongest candidate genes. This is particularly important in the
context of rapid global change, helping to understand the mechanisms used by organisms to
adapt to varying environmental conditions.
Likewise for A. m. mellifera, it is important for A. m. iberiensis to have a cost-effective
molecular tool capable of accurately detecting C-derived introgression. Reduced assays of highly
informative SNPs were developed from 176 WGs. In addition, both the effects of sample size and
of sampling a geographically restricted area on the number of highly informative SNPs were
tested. Results show that a bias is introduced when the sample size is small (N≤10) and when
sampling only captures a fraction of a population’s genetic diversity. The designed assays can be
readily used for monitoring populations not only in the native range of A. m. iberiensis but also in
the introduced range.
Another molecular marker widely used to assess the genetic diversity in honey bees is
the mitochondrial intergenic tRNAleu-cox2 region. Using mitogenome data from 123 individuals
representing seven subspecies, three lineages (A, M and C) and three African sub-lineages (AI, AII
and AIII), it was tested whether the information provided by this region is reliable for historical
inference. While the mitogenome analysis supports the three evolutionary lineages defined by the
tRNAleu-cox2 intergenic region, it does not support the existence of the three African sub-lineages.
Finally, different parts of the mitogenome provided distinct results, implying that the conclusions
drawn from studies using only one locus need to be taken with caution.
Overall, in this dissertation a set of accurate and reliable tools was developed to be used
in the preservation of the genetic integrity of honey bee populations of M-lineage ancestry.
Moreover, new insights into genetic basis of Iberian honey bee local adaptation were provided by
WGS and environmental data.A abelha-europeia, Apis mellifera L., exerce um papel essencial no ecossistema como
polinizador. No entanto, a sua integridade genética tem sido ameaçada por hibridação
introgressiva. Na tentativa de contribuir para contrariar esta tendência esta dissertação tem os
seguintes objetivos: (i) revelar a estrutura genética de uma das subespécies mais complexas da
Europa, a abelha ibérica (Apis mellifera iberiensis) e (ii) desenvolver ferramentas moleculares
para a abelha ibérica e para a abelha-negra (Apis mellifera mellifera), ambas pertencentes à
linhagem Europeia Ocidental ou M. Estas ferramentas podem ser usadas tanto em programas de
melhoramento como de conservação.
A abelha-negra tem sido ameaçada pela hibridação com subespécies da Europa Oriental
(linhagem C), como a A. m. ligustica e a A. m. carnica. Usando como base 113 abelhas
haploides provenientes de oito países genotipadas com 1183 na GoldenGate® Assay, foram
desenvolvidos cinco painéis com 48, 96, 144, 192 e 384 SNPs (adequados para a tecnologia
GoldenGate® Assay) com o objetivo de estimar introgressão da linhagem C em A. m. mellifera.
Todos os painéis tiveram estimativas de introgressão semelhantes à obtida quando os 1183
SNPs foram usados (r≥0,997).
A descontinuação da GoldenGate® Assay e a necessidade de um método para
monitorizar a introgressão numa vasta área geográfica motivaram o desenvolvimento de quatro
painéis de SNPs apropriados para o sistema iPLEX MassARRAY, tendo como base o painel de
144 SNPs, anteriormente desenvolvido. No final foi divulgada uma ferramenta precisa e
económica, juntamente com toda a informação genética dos 117 SNPs, para uma aplicação
imediata em estudos genéticos e de conservação da A. m. mellifera. O desempenho deste painel
foi avaliado por intermédio de 27 genomas e usando indivíduos obtidos por cruzamentos
controlados. Adicionalmente foram efetuados testes de sensibilidade que demonstraram que
esta técnica permite a deteção de alelos da linhagem C, mesmo quando em baixas frequências
(diluído de 1:20 numa pool de DNA e na proporção 1 F1:7 A. m. mellifera numa pool de
tecidos).
Contrariamente à A. m. mellifera, as populações de A. m. iberiensis ainda não estão
ameaçadas e têm uma estrutura genética complexa. Os processos neutrais tiveram um papel
importante na moldagem da diversidade genética, no entanto o papel da seleção não pode ser
ignorado. Por isso, foram procurados sinais de seleção usando um total de 87 genomas de
abelhas ibéricas, três métodos (Samβada, LFMM e PCAdapt) e dois tipos de dados (genómicos e ambientais). Os SNPs detetados por pelo menos dois destes métodos foram analisados usando
métodos haplótipicos e modelação de proteínas. Entre os 830 SNPs com sinais de seleção,
90,2% estão em regiões não codificantes, sugerindo que a regulação tem um papel crucial na
adaptação local. Foi também encontrado um enriquecimento de SNPs não-sinónimos, três deles
levam à substituição de aminoácidos situados dentro ou perto de locais funcionais de proteínas
relacionadas com lípidos e transporte transmembranar. Usando dados genéticos ambientais
foram identificados genes relacionados com adaptação a diferentes climas. Curiosamente, os
candidatos mais fortes foram genes relacionados com a membrana e o relógio circadiano que
permitem que o organismo detete e se adapte a variações ambientais. Estudos de adaptação
local são especialmente importantes no contexto das mudanças climáticas, ajudando a perceber
quais os mecanismos usados para a adaptação a diferentes condições ambientais.
Ferramentas moleculares económicas e precisas para estimar a introgressão da
linhagem C são tão importantes para a A. m. mellifera como para a A. m. iberiensis, por isso
quatro painéis ultra-reduzidos foram desenvolvidos usando o genoma completo de 176
indivíduos. Adicionalmente, os efeitos do tamanho da amostra e da amostragem
geograficamente confinada foram avaliados no número de SNPs fixos. Verificou-se que existe um
enviesamento quando o tamanho da amostra é ≤10 e quando a amostragem representa uma
pequena porção da diversidade genética. Os painéis ultra-reduzidos podem ser utilizados na
monitorização da integridade genética não só na área nativa mas também em locais onde a
abelha ibérica foi introduzida.
Outro marcador muito usado na avaliação da diversidade genética das abelhas é a
região intergénica tRNAleu-cox2 do DNA mitocondrial. Usando dados do mitogenoma de 123
indivíduos de sete subespécies diferentes, três linhagens (A, M e C) e três sublinhagens africanas
(AI, AII e AIII), foi testado se esta região é fidedigna para inferência histórica. As análises
mitogenómicas suportam as três linhagens evolutivas definidas por essa região intergénica mas
não sustentam a existência das três sub-linhagens africanas. É também de salientar que
diferentes partes do mitogenoma fornecem diferentes resultados, sugerindo que as conclusões
retiradas de estudos que utilizem um só locus devem ser tomadas com precaução.
Nesta dissertação foram desenvolvidas ferramentas precisas e fidedignas que podem ser
usadas para a preservação da integridade genética das populações europeias de abelhas da
linhagem M. Os dados de sequenciação e ambientais ajudaram na compreensão da base
genética da adaptação local da abelha ibérica.A sua execução foi financiada pela Bolsa de Doutoramento SFRH/BD/84195/2012, atribuída pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT). Contou ainda com os recursos disponibilizados pelo projecto BeeHope: 2013‐2014 BiodivERsA/FACCE‐JPI (joint call for research proposals, with the national funders FCT, Portugal, CNRS, France, and MEC, Spain) e do projeto COMPETE/QREN/EU (PTDC/BIABEC/099640/2008)