Tese de Doutoramento em MedicinaMassive rotator cuff tears (MRCTs) are very large tears that are difficult to repair and often
associated to an uncertain prognosis. These lesions are usually degenerative and may be
associated with chronic pain and severe functional impairments. They are extremely frequent
with advancing age, leading to great suffering and limitations in affected patients. The
musculo-tendinous degenerative changes associated to chronic MRCTs and, the low natural
healing and regeneration potential of the rotator cuff Tendon-Bone interface (TBi) represents a
difficult challenge, thereby imposing the development of new therapeutic strategies. Several
clinical solutions (e.g. surgical repair, tendon transfers, reverse shoulder arthroplasty and,
superior capsule reconstruction) have been addressed to tackle this problem. However, none of
them have been, so far, satisfactory, imposing the need for innovative therapeutical
approaches.
Several studies have proposed the use of stem cells as a possible tool for tendon healing and
regeneration, and within it, human mesenchymal stem cells (hMSCs) have emerged as a valid
therapeutic option. Most of their therapeutic effects are attributed to their capacity of secreting
a wide panel of trophic factors (secretome) capable of inducing modulation and regenerative
processes in the affected regions. Having this in mind the present thesis aimed at developing
innovative strategies for MRCT regenerative medicine based on hMSCs, their secretome and
the combination of them with nanopatterned based biodegradable biomaterials.
For this purpose a MRCT rat model was initially established by sectioning bilaterally the
supraspinatus and infraspinatus tendons. Interestingly, with the use of a bilateral lesion, our
results demonstrated that the degenerative changes were aggravated in a more accurate way,
resembling those observed in human tissues. Consequently, the described animal model
represented a key step for the assessment of therapeutic strategies aiming at
preventing/reverting chronic musculo-tendinous changes and/or enhancing the potential
healing of TBi.
After this, considering the importance of muscle quality on TBi healing and surgical outcomes when repair is attempted, the effect of hMSCs secretome on the prevention of muscle
degeneration after inflicting a MRCT was analyzed. It was observed that the injection of
hMSCs secretome immediately after the lesion was established, could decrease the
development of muscle degeneration in a rodent model of MRCT. In addition, both precise
intramuscular local injection and multiple systemic secretome injections shown to be
promising delivery forms for preventing muscle degeneration. This strategy is particularly
important for patients whose tendon healing after later surgical repair could be compromised
by the progressing degenerative changes.
Finally, the impact of a Tissue Engineering (TE) strategy based on the combination of an
electrospun keratin scaffold seeded with hMSCs secretome-preconditioned human tendon
cells (hTCs) to improve rotator cuff TBi healing, without surgical repair, was assessed. Initial
in vitro data revealed that hMSCs secretome increased hTCs phenotype, particularly the
expression of extracellular matrix associated molecules, as well as their cell densities, and
viability. A proteomic characterization of hMSCs secretome, revealed the presence of specific
proteins (e.g. Follistatin, Pigment epithelium-derived factor (PEDF), IL-6, decorin, and
biglycan) involved in muscle homeostasis and TBi healing, which are most likely linked to
these phenomena. Subsequent experiments performed in a MRCT rat animal model
(previously described and discussed) revealed that preconditioning hTCs with the hMSCs
secretome in a TE strategy yielded improved rotator cuff TBi healing.
In summary, the present work indicates that hMSCs, and their secretome, could represent a
potential tool to help treating and improve MRCT outcomes. Nevertheless, we should keep in
mind that its application in the future should be combined with other different approaches,
particularly those that use TE concepts. These findings are of clinical and social relevance as
they bring a new perspective for the prevention and treatment of MRCT aiming to improve the
quality of life of these patients.As roturas massivas da coifa dos rotadores (RMCR) são roturas grandes, difíceis de reparar e
muitas vezes associadas a um prognóstico incerto. Estas lesões são geralmente degenerativas e
podem causar dor crónica e incapacidade funcional graves. As RMCR são mais frequentes
com o avançar da idade, levando a um aumento da sintomatologia e limitação funcional. As
alterações degenerativas músculo-tendinosas associadas às RMCR crónicas e o baixo
potencial natural de cicatrização e regeneração da interface Osso-Tendão (iOT) da coifa dos
rotadores representam um desafio difícil, impondo assim o desenvolvimento de novas
estratégias terapêuticas. Várias soluções clínicas (e.g. reparação cirúrgica, transferências
tendinosas, artroplastia invertida do ombro e reconstrução da cápsula superior) têm sido
usadas para tentar resolver este problema. No entanto, nenhuma destas opções tem sido
satisfatória, até agora, impondo a necessidade de terapêuticas inovadoras.
Vários estudos têm proposto o uso de células-estaminais como uma possível ferramenta para a
cicatrização e regeneração do tendão e, dentro destas, as células-estaminais mesenquimatosas
humanas (CEMh) emergiram como uma opção terapêutica válida. A maior parte dos seus
efeitos terapêuticos é atribuída à sua capacidade de segregar um vasto painel de fatores
tróficos (secretoma) que são capazes de induzir modulação e processos regenerativos nas
regiões afetadas. Tendo isto em mente, a presente tese teve como objetivos o desenvolvimento
de estratégias inovadoras para a medicina regenerativa das RMCR baseada em CEMh, o seu
secretoma e a combinação deles com biomateriais biodegradáveis baseados em nanopartículas.
Para este propósito, um modelo de rato de RMCR foi inicialmente estabelecido através da
secção bilateral dos tendões supra-espinhoso e infra-espinhoso. Curiosamente, os nossos
resultados demonstraram que usando a lesão bilateral, as alterações degenerativas foram
agravadas de forma mais consistente e semelhante aquelas observadas nos tecidos humanos.
Consequentemente, o modelo animal descrito representou um passo chave para a avaliação de
estratégias terapêuticas visando a prevenção/reversão de alterações músculo-tendinosas
crónicas e/ou o aumento do potencial de cicatrização da iOT. Depois disso, e considerando a importância da qualidade do músculo na cicatrização da iOT e
dos resultados cirúrgicos quando a reparação é tentada, foi analisado o efeito do secretoma das
CEMh sobre a prevenção de degeneração muscular após induzir uma RMCR. Os resultados
demonstraram que a injeção de secretoma das CEMh, imediatamente após a lesão ser
estabelecida, poderia diminuir o desenvolvimento de degeneração muscular num modelo de
rato de RMCR. Além disso, tanto a injeção local precisa intramuscular quanto as injeções
sistémicas múltiplas de secretoma mostraram ser formas de administração promissoras para
prevenir a degeneração muscular. Esta estratégia é particularmente importante para os
pacientes cuja cicatrização do tendão após a posterior reparação cirúrgica poderia ser
comprometida pelas alterações degenerativas progressivas.
Por fim, avaliou-se o impacto de uma estratégia de Engenharia de Tecidos (ET) baseada na
combinação de uma matriz de queratina electroalinhada semeada com células tendinosas
humanas (CTh) pré-condicionadas pelo secretoma das CEMh para melhorar a cicatrização da
iOT da coifa dos rotadores, sem reparação cirúrgica associada. Os dados iniciais in vitro
revelaram que o secretoma das CEMh aumentaram o fenótipo das CTh, particularmente a
expressão de moléculas associadas à matriz extracelular, bem como a sua viabilidade e
densidades celulares. A caracterização proteómica do secretoma das CEMh, revelou a
presença de proteínas específicas (e.g. Follistatina, fator derivado do epitélio pigmentado
(FDEP); IL-6, decorina, and biglycano) envolvidos na homeostasia muscular e cicatrização da
iOT, e que estão muito provavelmente ligados a estas ações. Experiências subsequentes
realizadas no modelo animal de rato de RMCR (anteriormente descrito e discutido) revelaram
que o pré-condicionamento de CTh com o secretoma das CEMh, numa estratégia de ET,
proporcionou uma melhoria da cicatrização da iOT da coifa dos rotadores.
Em resumo, o presente trabalho indica que as CEMh, e o seu secretoma, podem representar
um instrumento potencial para ajudar a tratar e melhorar os resultados clínicos das RMCR. No
entanto, devemos ter em mente que a sua aplicação futura deve ser combinada com outras
abordagens diferentes, particularmente aquelas que utilizam conceitos de ET. Estes achados
são de relevância clínica e social, uma vez que trazem uma nova perspetiva para a prevenção e
tratamento das RMCR visando melhorar a qualidade de vida desses pacientes.The work presented in this thesis was performed in the Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), Minho University. Financial support was provided by FEDER funds through the Operational Programme Competitiveness Factors - COMPETE and National Funds through FCT - Foundation for Science and Technology under the project POCI-01-0145-FEDER-007038; and by the project NORTE-01-0145-FEDER-
000013, supported by Norte Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF)