Fernandes, Fabiano A. N.

Gudiña, Eduardo J.

Meneses, D.

Rodrigues, Ana Isabel

Rodrigues, L. R.

Rodrigues, Sueli

Universidade do Minho: RepositoriUM

     PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR Aureobasidium thailandense UTILIZANDO RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS   D. P. MENESES1, E. GUDIÑA2, A. I. RODRIGUES2, F. FERNANDES1, L. RODRIGUES2, S. RODRIGUES1  1 Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia, Departamento de Engenharia Química  2Universidade do Minho, Centro de Engenharia Biológica, Instituto de Bioengenharia e Biotecnologia E-mail para contato: dayana_meneses@yahoo.com.br   RESUMO – Os biossurfactantes são moléculas anfipáticas que atuam na redução da tensão superficial e interfacial de líquidos. O objetivo desse trabalho foi avaliar a produção de biossurfactante por Aureobasidium thailandense utilizando água residual da produção de azeite (OMW) e água de maceração do milho (CSL). Um estudo preliminar verificou o efeito negativo de CSL na redução de tensão superficial. Dessa forma, foi realizado o planejamento fatorial completo (22) para otimizar o meio de cultura utilizando extrato de levedura. O ponto de máxima redução de tensão (∆TS) foi obtido com: 2 g/L de extrato de levedura, 1,5% (v/v) de OMW, 6 g/L de glicose com  ∆TS = 28 ± 2,6 mN/m no caldo fermentado. Dessa forma o estudo mostrou que a produção do biossurfactante por A. thailandense sob condições otimizadas favoreceu a produção de um bom tensoativo.  1. INTRODUÇÃO Os biossurfactantes são moléculas anfipáticas que atuam na redução da tensão superficial e interfacial de líquidos. Essas propriedades permitem a sua aplicação em diversas áreas comerciais, entre elas as indústrias alimentícia, farmacêutica, petroquímica, agrícola e de cosméticos (Sakthipriya et al., 2015; Al-wahaibi et al., 2014). Os biotensoativos possuem relevantes vantagens sobre os surfactantes de origem petroquímica, sendo as suas principais características a biodegradabilidade, estabilidade e o fato de conseguirem atuar sobre condições extremas de pH, temperatura e salinidade (Hassan et al., 2016). Uma diversidade de microrganismos, em sua maioria bactérias (Pseudomonas e Bacillus), leveduras (Candida) e, em menor quantidade, os fungos filamentosos são produtores de biossurfactantes (Desai; Banat, 1997). As leveduras possuem uma vantagem frente às bactérias, pois em sua maioria são organismos com Status Generally Regarded as Safe (GRAS) e, portanto, não apresentam riscos de toxicidade e patogenicidade para aplicação em indústria alimentícia e farmacêutica (Fontes; Amaral; Coelho, 2010).     O isolamento de novas culturas, bem como a utilização de substratos de baixo-custo e a otimização do processo fermentativo podem levar a síntese de biossurfactantes novos. A substituição das matérias-primas industrializadas por produtos e/ou subprodutos da indústria alimentícia tem se mostrado uma alternativa viável, pois corresponde a cerca de 30% do valor total da sua produção (Hazra et al., 2010; Banat et al., 2014).   Dessa forma, o objetivo desse estudo foi a produção de biossurfactante por Aureobasidium thailandense, utilizando o resíduo da produção de azeite (OMW) e o extrato de levedura como fonte de carbono e nitrogênio no meio de fermentação.  2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Inóculo A cultura de Aureobasidium thailandense foi isolada do pedúnculo do caju (Anacardium accidentale L.) pelo Laboratório de Biotecnologia - LABIOTEC, da Universidade Federal do Ceará (UFC). O microrganismo foi identificado por técnicas de biologia molecular. O inóculo foi preparado em caldo YPD (yeast peptone dextrose) em shaker orbital a 200 rpm e 28 °C. A concentração de células para o início da fermentação foi de 1x107 cel/mL, na proporção de 5 % (v/v).  2.2 Produção do biossurfactante A cepa de Aureobasidium thailandense foi submetida a testes preliminares com diferentes fontes de carbono (melaço, glicose, azeite de oliva e água residual da produção de azeite – OMW) e nitrogênio (extrato de levedura e água de maceração do milho – CSL). A partir desses resultados foi selecionado o meio de cultura que favoreceu a maior redução de tensão superficial do caldo fermentado: glicose (6 g/L),  extrato de levedura (3 g/L), OMW (2% v/v), KH2PO4 (1 g/L) e o tempo de fermentação (48 horas) para realização do  planejamento experimental.   2.2.3 Otimização do meio de cultura: A fermentação submersa foi realizada em skaker orbital por 48 horas, a 200 rpm e 28 °C, pH 5,5 em Erlenmeyer contendo 200 mL de meio de cultura. As amostras foram coletadas no intervalo de 24 horas e submetidas à centrifugação (4000 rpm,15 min) para obtenção do sobrenadante para realização das análises. Um fatorial fracionado 23-1, incluindo 3 repetições no ponto central, totalizando 7 ensaios, foi realizado com objetivo de analisar o efeito das fontes de nitrogênio e concentração de OMW (Tabela 1). Os valores foram gerados no Software Statistica v 7.0 (Statsoft).       Tabela 1 – Fatorial fracionado (23-1) para selecionar as variáveis mais significativas segundo seus efeitos Ensaios Extrato de leveduras (g/L) OMW (v/v) % CSL (g/L) 1 1,0 1,0 2,0 2 2,0 1,0 1,0 3 1,0 3,0 1,0 4 2,0 3,0 2,0 5 (C) 1,5 2,0 1,5 6 (C) 1,5 2,0 1,5 7 (C) 1,5 2,0 1,5  Um planejamento fatorial completo (CCRD) foi realizado para otimizar as concentrações de extrato de levedura e da água residual da produção de azeite, que foram as variáveis com efeito positivo de acordo com o planejamento fatorial fracionado. O experimento foi conduzido com duas variáveis em dois níveis (22) incluindo 4 ensaios nas condições axiais e três repetições no ponto central, totalizando 11 ensaios (Tabela 2). O planejamento foi gerado no Software Statistica v 7.0 (Statsoft).  Tabela 2 – Planejamento completo para otimização do meio de cultura (DCCR- 22) Ensaios OMW (v/v) % Extrato de levedura (g/L) 1 1,00 1,50 2 1,00 4,50 3 1,00 1,50 4 3,00 4,50 5 0,58 3,00 6 3,41 3,00 7 2,00 0,87 8 2,00 5,12 9 (C) 2,00 3,00 10 (C) 2,00 3,00 11 (C) 2,00 3,00  2.3 Métodos analíticos 2.3.1 Determinação da tensão superficial: A tensão superficial foi medida no tensiômetro modelo alemão Kruss (K-6), que utiliza o método do anel (RODRIGUES et al., 2006). As análises foram     realizadas com o sobrenadante obtido após a centrifugação da amostra bruta, a uma temperatura de 25ºC. Foram realizadas três medidas para cada ponto em estudo, sendo considerada a média aritmética dos resultados. 2.3.2 índice de emulsificação: O índice foi determinado de acordo com o método de Wei et al. (2005). Foram adicionados a tubos de ensaio 2,0 mL do sobrenadante e 2,0 mL de hexadecano. A mistura foi agitada em vórtex por 2 minutos e permaneceu em repouso por 24 horas. O índice de emulsificação foi determinado pela Equação (1).  𝑬 =𝑯𝒆𝒎𝒖𝒍𝒔ã𝒐 𝑯𝒕× 𝟏𝟎𝟎                                                                                                           (1)  Onde: E24 = índice de emulsificação após 24 h (%) Hemulsão = Altura da emulsão (cm) Ht = Altura total   3. RESULTADOS E DISCUSSÃO O Diagrama de Pareto gerado pelo planejamento fatorial fracionado (23-1) pode ser observado através da Figura 1.   Figura 1 – Diagrama de Pareto com o efeito estimado das fontes de nitrogênio e carbono na produção de biossurfactante por A. thailandense  24     Através do Diagrama de Pareto (Figura 1), observa-se que a água de maceração do milho (CSL) apresentou efeito significativo e negativo e a água residual (olive mill wastewater - OMW) apresentou efeito significativo e positivo (p<0,1). O efeito negativo do CSL pode estar relacionado as condições limitantes de nitrogênio, pois segundo Santos et al. (2002) o uso de uma fonte lentamente metabolizada, pode ter um efeito semelhante aos baixos níveis de nitrogênio, que reduz a síntese de enzimas envolvidas na produção de lipídeos e consequentemente  do biossurfactante. Portanto o extrato de levedura foi uma fonte de nitrogênio mais disponível a síntese do biossurfactante tendo apresentado um efeito positivo. Os resultados do planejamento composto central (DCCR) 22 estão apresentados na Tabela 3 e sua respectiva superfície de reposta na Figura 2. A produção do biossurfactante resultou em bons valores de redução de tensão superficial, na faixa de  ∆TS 21 mN/m a 29 mN/m (Tabela 3). Fontes et al. (2012) relataram o aproveitamento de duas fontes de carbono na produção de surfactante por Yarrowia lipolytica, o estudo demonstrou que o glicerol e o suco de caju clarificado apresentaram ∆ST de 22 mN/m e 18 mN/m, respectivamente.    Tabela 3 – Valores do planejamento composto central (22) para produção de biossurfactantes por A. thailandense durante 48 horas de fermentação Ensaios Extrato de levedura (g/L) OMW (%) Tensão superficial (mN/m) E24(%)        TSI TSF ∆TS 1 1,50 1,00 60 31 29 40,0 2 4,50 1,00 53 30 23 40,0 3 1,50 1,00 53 30 23 20,0 4 4,50 3,00 50 29 21 66,6 5 3,00 0,58 55 30 25 60,0 6 3,00 3,4 50 29 21 66,6 7 0,87 2,00 55 30 25 16,6 8 5,10 2,00 51 30 21 50,0 9 (C) 3,00 2,00 55 29 26 63,3 10(C) 3,00 2,00 56 29 27 60,0 11 (C) 3,00 2,00 58 30 28 63,0                      TSI;f: Tensão superficial inicial/final; ∆TS: redução da tensão superficial; E24: índice de emulsão   O modelo de regressão obtido para predizer a redução da tensão superficial está representado pela Equação 2. O  Fcalculado (13,47) para o modelo estatístico foi maior que o Ftabelado (5,05) ao nível de confiança de 95%. Pode-se concluir que o modelo se ajusta aos dados experimentais (R2 = 0,93), demonstrando proximidade entre os resultados experimentais e os valores teóricos previstos pelos resultados obtidos na Equação 2.      Z = 17,9 + 3,95x – 0,87x2 + 5,85y – 1,97y2 + 0,21xy                                                                           (2)  Onde:  Z = Redução da tensão superficial (mN/m); Y = Concentração de OMW % (v/v); X = Concentração de extrato de levedura (g/L).   Figura 2– Superfície de resposta obtida a partir dos resultados do planejamento experimental para a otimização das concentrações de extrato de levedura e OMW para produção de biossurfactante por A. thailandense.  Para a validação do planejamento (DCCR) foi realizado a repetição segundo os valores críticos (2 g/L de extrato de levedura e 1,5 % de OMW) gerados a partir da superfície de resposta.  A Tabela 4 demonstra esses valores.  Tabela 4 – Resultados da validação do planejamento experimental (DCCR) Tempo (h) ∆ Tensão superficial obtida (mN/m)  ∆ Tensão superficial estimada (mN/m) 48 28 ± 2,6a 28,16a Valores são média ± desvio. Valores com letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).   De acordo com os valores observados na Tabela 4, os valores obtidos experimentalmente não Fitted Surface; Variable: Var tensão superf 48h2 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Residual=1,074516DV: Var tensão superf 48h > 28  < 28  < 24  < 20  < 16  < 12 01234Águas russas12345Extrato delevedura1216202428Variação natensãosuperficial (48h)    diferiram significativamente dos estimados pelo planejamento experimental (DCCR). A composição do meio de cultura otimizado reduziu em 66% a concentração de extrato de levedura utilizado nos ensaios iniciais. Pode-se observar que a concentração ideal da fonte hidrofóbica de carbono (OMW), favoreceu o aumento da produção do tensoativo, assim como citado por Bajaj et al. (2012) que descreveram a importância desse parâmetro para a síntese de biossurfactante. Certos microrganismos possuem apenas a capacidade para produzir moléculas com características emulsificante, como reportado por Taran et al. (2012) a partir de Haloarcula sp. em meio contento 4% de azeite de oliva (E24=40%). Não foram encontrados estudos para a levedura A. thailandense que possam relacioná-la com sua capacidade de produzir surfactantes, apenas outras espécies como A. pullulans (KIM et al., 2015).  4. CONCLUSÃO Pode-se observar que o planejamento experimental foi uma ótima ferramenta para o estudo das condições ideais na produção do biossurfactante. O meio de cultura otimizado permitiu uma redução da tensão superficial de 28 mN/m em 48 horas de fermentação a partir de baixas concentrações de extrato de levedura (2 g/L) e glicose (6 g/L), utilizando 1,5% (v/v) do resíduo da produção de azeite de oliva (olive mill waste water) como fonte de carbono hidrofóbica.  Conclui-se que a cepa de Aureobasidium thailandense produziu um bom surfactante, sendo portanto, um bioproduto em potencial devido suas características tensoativas e emulsificante.  5. REFERÊNCIAS  Abdel-Shafy, H. I.;Schories, G.; Mohamed-Mansour, M.S.;Bordei, V.  Integrated membranes for the recovery and concentration of antioxidant from olive mill wastewater. Desalin Water Treat, v. 56, n. 2, p. 305-314, 2015. BAJAJ, V.; TILAY, A.; ANNAPURE, U. Enhanced Production of Bioactive Sophorolipids by Starmerella bombicola NRRL Y-17069 by Design of Experiment Approach with Successive Purification and Characterization. J. Oleo. Sci. , v. 61, n. 7, p. 377–386, 2012.   BANAT, Ibrahim M et al, Cost effective technologies and renewable substrates for biosurfactants production. Front. Microbiol., v. 5, n. December, p. 697, 2014.  DESAI, J.; BANAT, I. M Microbial Production of Surfactants and Their Commercial Potential.Microbiol. Mol. Biol. Rev.,v. 61, n. 1, p. 47–64, 1997.      FONTES, G. C. et al. Factorial design to optimize biosurfactant production by Yarrowia lipolytica. J Biomed Biotechnol., v. 2010, p. 821306, jan. 2010.   FONTES, G. C. et al. Renewable resources for biosurfactant production by yarrowia lipolytica.Braz. Braz. J. Chem. Eng.,  v. 29, n. 03, p. 483–493, 2012.   HASSAN, Mariam et al. Optimization of rhamnolipid production by biodegrading bacterial isolates using Plackett–Burman design.Int. J. Biol. Macromol., v. 82, p. 573–579, 2016.  HAZRA, Chinmay et al. Screening and identification of Pseudomonas aeruginosa AB4 for improved production, characterization and application of a glycolipid biosurfactant using low-cost agro-based raw materials, J. Chem. Technol. Biot., v. 86, n. 2, p. 185–198, 2011.  KIM, J. S.; LEE, I. K.; YUN, B. S. A novel biosurfactant produced by Aureobasidium pullulans L3-GPY from a tiger lily wild flower, Lilium lancifolium Thunb. PloS one, v. 10, n. 4, p.122917, jan. 2015.   RODRIGUES, L. R. et al. Physicochemical and functional characterization of a biosurfactant produced by Lactococcus lactis 53, Colloids Surf B Biointerfaces, v. 49, n. 1, p. 79–86, 2006.  SANTOS, A. S. et al. Evaluation of different carbon and nitrogen sources in production of biosurfactant by Pseudomonas fluorescens.  Appl Biochem Biotechnol., v. 223, n. 3, p. 143-151, 2002.  SAKTHIPRIYA, N; DOBLE, M.; SANGWAI, J. S. International Biodeterioration & Biodegradation Action of biosurfactant producing thermophilic Bacillus subtilis on waxy crude oil and long chain paraffins,Int Biodeterior Biodegradation, v. 105, p. 168–177, 2015.  TARAN, Mojtaba et al. Surface active agent production from olive oil in high salt conditions and its process optimization.Pol J Chem Technol., v. 14, p. 30–34, 2012.  WEI, Y. H.; CHOU, C. L.; CHANG, J. S. Rhamnolipid production by indigenous Pseudomonas aeruginosa J4 originating from petrochemical wastewater. Chem Eng J Bioch Eng. 27, 146–154. 2005.   

Produção de biossurfactante por Aureobasidium thailandense utilizando resíduos agroindustriais

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