Tese de Doutoramento em Ciências da SaúdeBovine tuberculosis (bTB) is a chronic slow-progressing zoonotic disease of livestock and wildlife
caused by infection with Mycobacterium bovis or the closely related Mycobacterium caprae, both
members of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC). In the Iberian Peninsula bTB is
maintained in a multi-host pathogen system, with M. bovis and M. caprae circulating between
sympatric wild ungulates and free-ranging domestic ungulates. This epidemiological model was
investigated as part of the present PhD thesis in order to elucidate the mechanisms of intra- and
inter-specific transmission and the spatial epidemiology of bTB in Iberian wildlife.
A systematic bibliographic review of the epidemiology of bTB in Iberian Peninsula suggests it is
an endemic disease of autochthonous wild ungulates, with wild boar ( Sus scrofa) and red deer
( Cervus elaphus) acting as maintenance hosts. Bovine tuberculosis is an emergent disease in
these species, with expansion from a core high-prevalence area in south-western Iberian
Peninsula being fuelled by high host densities. Such high densities are due to intensive
management for hunting purposes, including interventions such as removal of predators, fencing,
translocation, artificial provision of food and water and even medication.
We investigated MTC excretion routes and concentration of MTC in biological samples from
potential routes of excretion and reported for the first time the detection of MTC excretion from
83.0 % (CI95 70.8–90.8 %) of naturally-infected wild boar and red deer. MTC DNA was amplified
in all types of excretion routes (oronasal, bronchial-alveolar, fecal and urinary). MTC
concentrations greater than the minimum infective doses for cattle, red deer or wild boar were
estimated in excretion routes from wild boar and red deer. Also for the first time we provided
evidence for the existence of a proportion of super-shedders within the naturally-infected
populations of these host species (28.2 % of infected wild boar, CI95 16.6–43.8 %; and 35.7 % of
infected red deer, CI95 16.3–61.2 %). These super-shedders are responsible for a
disproportionately large amount of MTC excretion from infected wild ungulates.
Also we defined an improved protocol for the molecular detection and estimation of the
concentration of MTC and M. bovis/ caprae DNA in environmental samples and applied this
protocol to assess MTC environmental contamination in areas with well-described distinct bTB prevalence in wildlife. We reported for the first time the widespread occurrence of MTC DNA in
the environment in areas where bTB has a high prevalence in wildlife. Seasonal rates of detection
of MTC in environmental samples can be as high as 39.6 % (CI95 27.6–53.6 %) in the spring.
This contamination was detected in all types of a priori defined risk sites, where wild and
domestic ungulates assemble, such as feeding and watering places.
We also assessed the spatial epidemiology of wildlife bTB in Portugal based on serological and
bacteriological culture surveys. As a first step we confirmed that elutes from absorbent paper is a
valuable new tool for bTB serological surveys in wild boar populations. Our data allowed for the
confirmation of bTB as an emerging disease in wildlife in Portugal, documenting a 47 % increase
in prevalence in one area from 2005-06 to 2009-14. Also we confirmed previous data suggesting
a strong spatial structure of wildlife bTB, with 2 spatial clusters identified in south- and centraleasternmost
Portugal, in the periphery of the high-prevalence core area in central-southwestern
Iberian Peninsula. Further we obtained 2 geographical risk models of bTB in wildlife at national
and regional scales, both models generally agreeing with independent studies reporting MTC
isolation from wild hosts.
These results have implications for the design of control programs in wildlife, including the
selective targeting of super-shedder individuals in culling actions, the identification of high-risk
transmission sites as targets for the implementation of biosecurity measures and risk-based
surveillance and control based on spatial risk models.A tuberculose bovina (bTB) é uma doença zoonótica crónica e de progressão lenta, que afeta
animais domésticos e selvagens, sendo causada pela infeção por Mycobacterium bovis ou por
Mycobacterium caprae, ambos pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC).
Na Península Ibérica a bTB é mantida num sistema multi-hospedeiro, em que M. bovis e M.
caprae circulam em populações simpátricas de ungulados selvagens e domésticos. Este modelo
epidemiológico foi objeto de estudo na presente tese de doutoramento, tendo em vista contribuir
para o conhecimento dos mecanismos de transmissão intra- e inter-específica e da epidemiologia
espacial da bTB na fauna selvagem Ibérica.
Uma revisão sistemática da bibliografia sobre epidemiologia da bTB na Península Ibérica sugere
que esta é uma doença endémica dos ungulados selvagens autóctones, sendo o javali ( Sus
scrofa) e o veado ( Cervus elaphus) hospedeiros de manutenção. A bTB é uma doença emergente
nestas espécies, sendo a expansão a partir do núcleo de alta prevalência no centro-sudoeste da
Península Ibérica alimentado pelas altas densidades de hospedeiros selvagens. Essas
densidades são mantidas artificialmente elevadas pelo maneio intensivo para fins cinegéticos,
incluindo remoção de predadores, vedação, translocação, alimentação e abeberamento artificial
e mesmo medicação.
Investigámos também as potenciais vias de excreção e respetivas concentrações de MTC e
documentámos pela primeira vez a excreção de MTC em 83,0 % (IC95 70,8–90,8 %) dos javalis e
veados naturalmente infetados. Detetámos DNA de MTC em todos os tipos de vias de excreção
estudadas (oronasal, bronquio-alveolar, fecal e urinária). Nestas vias de excreção estimámos
concentrações de MTC superiores à dose mínima infetante para bovinos, veados e javali.
Também pela primeira vez encontrámos evidência da existência de uma proporção de animais
super-excretores na população infetada (28,2 % dos javalis infetados, IC95 16,6–43,8 %; e 35,7 %
dos veados infetados, IC95 16,3–61,2 %), os quais são responsáveis por uma excreção de MTC
desproporcionalmente elevada.
Também no âmbito desta tese descrevemos um protocolo melhorado para a deteção e
estimativa da concentração de DNA de MTC e M. bovis/ caprae em amostras ambientais, e aplicámos esse protocolo para caracterizar a contaminação ambiental com estas micobactérias
em zonas com diferentes prevalências de bTB na fauna selvagem. Pela primeira vez reportámos
uma contaminação ambiental generalizada por MTC em zonas onde a bTB tem uma prevalência
elevada em populações de ungulados selvagens. A proporção de amostras positivas alcançou os
39,6 % (IC95 27,6–53,6 %) na primavera. Esta contaminação foi detetada em todos os tipos de
zonas de risco previamente identificadas, onde ungulados domésticos e selvagens se
concentram, como sejam zonas de alimentação e abeberamento.
Também avaliámos a epidemiologia espacial da bTB em Portugal com base em rastreios
sorológicos e cultura bacteriológica. Inicialmente validámos as eluições de sangue embebido em
papel absorvente como um novo método para rastreios sorológicos de bTB em javali. Os
resultados confirmaram que a bTB é uma doença emergente da fauna selvagem em Portugal,
documentando um aumento de 47 % da prevalência numa zona entre 2005-06 e 2009-14.
Também confirmámos a ocorrência de uma marcada estruturação espacial da bTB na fauna
selvagem, com 2 agregados espaciais no sul- e centro-leste de Portugal, localizados na periferia
do núcleo da alta prevalência anteriormente descrito no centro-sudoeste da Península Ibérica.
Produzimos 2 modelos geográficos de risco da bTB na fauna selvagem à escala nacional e
regional, estando ambos em concordância com relatórios independentes do isolamento de MTC
em animais selvagens.
O conjunto destes resultados tem implicações para o desenho de programas de controlo da bTB
na fauna selvagem, nomeadamente através da remoção seletiva de super-excretores, da
identificação de locais de alto risco de transmissão indireta como alvos de medidas de
biossegurança e da vigilância e controlo da doença baseada nos modelos de risco espacial
desenvolvidos no âmbito desta tese.The work presented in this thesis was performed in the Microbiology and Infection Research Domain in the Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), School of Health Sciences, University of Minho, Braga, Portugal (ICVS/3B’s – PT Government Associate Laboratory, Braga/Guimarães, Portugal). The financial support was given by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) by means of a PhD grant (SFRH/BD/69390/2010)
