Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clinica)Ventilator-associated pneumonia (VAP) is one of the most common nosocomial
pneumonia among intensive care units contributing to high rates of morbidity and mortality.
Polymicrobial biofilm infections with Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans have
being recently reported in VAP. Their antimicrobial resistance profiles represent a serious
impact on the treatment of the disease by reducing the effective therapies and affecting the
state of health of patients. As such, the present work aimed to provide novel insights
concerning the characterization of single- and dual-species biofilms phenotype involving P.
aeruginosa and C. albicans under the presence of different antimicrobials agents. Planktonic
and biofilm assays were performed using P. aeruginosa PAO1, C. albicans SC5314 and four
clinically important antimicrobials: amphotericin B (AmB), tobramycin (ToB), colistin (CoL) and
polymyxin B (PolyB) as single or in combination. The quantitative methods (CFUs enumeration
and biomass quantification) and qualitative methods (SEM, PNA FISH analysis and LIVE/DEAD
staining) were used to study the single- and dual-species biofilms. The results showed that the
incubation time did not influence biofilm formed by both pathogens in the overall consortia.
Concerning single antimicrobials use, P. aeruginosa was the pathogen more sensitive to most
tested antimicrobials and their effect showed to be concentration and time dependent. For
antimicrobial combinations it was demonstrated that most formulations presented synergistic
effect in P. aeruginosa, both in single and in mixed planktonic cultures. Specially, when applied
to biofilms only AmB/PolyB and ToB/PolyB combinations (particularly with PolyB at high
concentrations: 256 mg/L), promoted a significant reduction in the number of cultivable cells
of both strains entrapped in single- and in dual-species biofilms. However, PNA FISH analysis
and LIVE/DEAD staining showed that both strains are still existent and viable in presence of
these antimicrobial combinations. In conclusion, different antimicrobial therapies used in this
work did not display any effectiveness in the treatment of polymicrobial infections associated
to VAP. Nevertheless, certain antimicrobial combinations tested in this work are essentials to
future studies in order to better clarify the clinical dosage concentrations. Despite of the
aforementioned concentrations being toxicity for humans they present strong potency to be
used in future novel methodologies for VAP therapy.A pneumonia associada a ventilação (PAV) é uma das pneumonias nosocomiais mais
comuns nas unidades de cuidados intensivos contribuindo para elevadas taxas de morbidade e
mortalidade. As infeções polimicrobianas associadas a biofilmes causadas por Pseudomonas
aeruginosa e Candida albicans têm sido recentemente relatadas na PAV. Os seus perfis de
resistência antimicrobiana representam um sério impacto no tratamento da doença, devido à
diminuição da eficácia das terapias afetando assim o estado de saúde dos pacientes. Desta
forma, o presente trabalho teve como objetivo aumentar o conhecimento relativo à
caracterização fenotípica de biofilmes simples e duplos envolvendo P. aeruginosa e C. albicans
na presença de diferentes agentes antimicrobianos. Para tal, foram realizados ensaios
planctônicos e de biofilmes utilizando P. aeruginosa PAO1, C. albicans SC5314 e quatro
agentes antimicrobianos de relevância clínica: anfotericina B (AmB), tobramicina (ToB),
colistina (COL) e polimixina B (PolyB), com utilização única ou em combinação. Os métodos
quantitativos (enumeração de unidades formadoras de colónias e quantificação de biomassa)
e métodos qualitativos (visualização em microscópio eletrónico de varrimento, análise PNAFISH
e coloração LIVE/ DEAD) foram realizados com o objetivo de estudar os biofilmes simples
e duplos. Os resultados mostraram que o tempo de incubação não influenciou a formação de
biofilme por parte de ambos os agentes patogénicos no consórcio global. Relativamente ao
uso de um único agente antimicrobiano, a bactéria P. aeruginosa foi o agente patogénico mais
sensível aos antimicrobianos testados revelando um efeito dependente da concentração e do
tempo. Para combinações de antimicrobianos foi demonstrado que a maioria das formulações
apresentaram efeito sinérgico em P. aeruginosa, tanto em culturas planctónicas simples como
mistas. Especialmente, quando aplicados em biofilmes, apenas as combinações AmB / PolyB e
ToB / PolyB (particularmente com PolyB a elevadas concentrações: 256 mg/L), promoveram
uma redução significativa no número de células viáveis e cultiváveis em ambas as estripes quer
em biofilmes simples ou duplos. No entanto, a análise PNA FISH e a coloração LIVE/DEAD
mostrou que ambas as estripes se encontravam presentes e viáveis na presença destas
combinações antimicrobianas. Em conclusão, as diferentes terapias antimicrobianas usadas
neste trabalho não apresentaram grande eficácia no tratamento de infeções polimicrobianas
associados à PAV. No entanto, certas combinações antimicrobianas, já testadas neste trabalho,
são essenciais para estudos futuros, a fim de melhor clarificar as concentrações de dosagem
clínicas. Apesar das concentrações acima referidas serem tóxicas para os seres humanos estas
apresentam forte potencial para serem usadas em futuras metodologias na terapia PAV