Dissertação de mestrado em Biofísica e BionanossistemasNos últimos anos, as células estaminais mesenquimais (CEM’s) têm sido foco de interesse na
comunidade científica devido à sua capacidade de diferenciação em diferentes linhagens celulares,
tais como adipócitos, osteoblastos e condrócitos. Neste trabalho, CEM’s humanas foram combinadas
com poli(fluoreto de vinilideno), PVDF, um polímero piezoelétrico biocompatível, de modo a
impulsionar a sua expansão e proliferação in vitro, com o objetivo principal de obter um substancial
número de células com fenótipo osteoblástico para regeneração de tecidos.
Com este propósito, filmes de PVDF em fase α foram submetidos a electrospray com
diferentes tempos de deposição, dando origem a dois substratos, com alta e baixa concentração de
micropartículas de β-PVDF. Foram também produzidas micropartículas sem substrato com vista a
criar um ambiente 3D e filmes planos de β-PVDF foram usados como referência. Antes do cultivo
celular, os marcadores superficiais celulares característicos de CEM’s (CD105, CD90 e CD73) foram
analisados por citometria de fluxo (CF). Quatro dias depois de serem cultivadas nos biomateriais, a
viabilidade celular foi examinada. Em paralelo, CF, microscopia eletrónica de varrimento (MEV) e
ensaios de imunocitoquímica de vinculina foram realizados de modo a avaliar a manutenção da
multipotencialidade das CEM’s e a sua morfologia nos diferentes substratos. Quando a confluência
celular foi atingida, foi introduzido um meio de diferenciação osteogénico e o cultivo continuou por 14
dias. Finalmente, CF e um ensaio de imunocitoquímica de osteocalcina foram realizados de modo a
avaliar como as diferentes topografias dos biomateriais influenciavam a diferenciação osteogénica.
A primeira análise de CF confirmou que as células utilizadas eram CEM’s humanas. No quarto
dia, os resultados de MTS mostraram que a proliferação foi similar em todos os substratos. A MEV e
o ensaio de imunocitoquímica de vinculina mostraram que as CEM’s adotaram diferentes morfologias
dependendo do biomaterial. Adicionalmente, CF mostrou uma perda de marcadores específicos das
CEM’s em meio de expansão e 14 dias depois da introdução de meio osteogénico, as células cultivadas
nos filmes planos e com micropartículas revelaram existência de osteocalcina e perda de marcadores.
Concluindo, as novas topografias com micropartículas de PVDF permitiram um incremento na
diferenciação de CEM’s. As células proliferaram satisfatoriamente e a morfologia adotada nos
substratos sugere aderência às microesferas. Concluindo, estes suportes mostraram induzir perda de
multipotencialidade das CEM’s cultivadas em meio de expansão, mesmo antes da confluência celular.Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have attracted great interest in the scientific community in
the past few years due to their differentiation potential towards cells belonging to the musculoskeletal
lineages, such as adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes. In this work, human MSCs were
combined with poly(vinylidenefluoride) (PVDF), a biocompatible piezoelectric polymer, allowing their in
vitro expansion and proliferation, with the main goal of obtaining an important number of cells with
osteoblastic phenotype for tissue regeneration.
With this purpose, α-phase PVDF films were subjected to PVDF electrospray with different
deposition times, producing two substrates, with high and low concentration of β-phase PVDF
microspheres. Microspheres only were also produced to create a 3D environment. Flat β-phase films
were used as reference. Before cell seeding, the characteristic cell surface markers of MSCs (CD105,
CD90 and CD73) were analyzed by flow cytometry (FC). Cells were cultured onto the biomaterials and
viability was assessed after 4 days. In parallel, FC, Scanning Electron Microscopy (SEM) and
immunocytochemistry of vinculin were performed in order to evaluate the maintenance of MSCs
multipotentiality and their morphology on the different substrates. When the confluence was reached,
osteogenic differentiation medium was introduced and the culture was continued for 14 days. Finally,
FC and an osteocalcin immunocytochemistry were performed in order to evaluate if the different
substrate morphologies influenced MSCs osteogenic differentiation.
First FC analysis confirmed that cells were actually human mesenchymal stem cells. At the
fourth day, MTS results showed similar proliferation in all the substrates. SEM and vinculin
immunocytochemistry have shown that a different morphology was adopted by MSCs depending on
the substrate. Also, FC indicated loss of specific MSCs markers in expansion medium. After 14 days
of osteogenic medium introduction, cells cultured on flat films and films with microspheres revealed
osteocalcin staining and again, loss of multipotentiality.
Concluding, this new shaped PVDF microspheres substrates were able to enhance hMSC’s
differentiation. Cells proliferated at high rate and their morphology in the substrates suggests that these
cells are adhering onto microspheres. Moreover, these supports’ topography induces loss of
multipotenciality in MSCs cultured in expansion medium, even before reaching confluence
