Doctoral Dissertation for PhD degree in Chemical and Biological EngineeringBreast cancer is the most prevalent cancer in women worldwide and its mortality is closely associated
with the development of metastasis of the primary tumor. It is currently the fifth cause of death from
cancer (522,000 deaths), with 1.67 million new breast cancer cases estimated in 2012. An early
diagnosis is crucial to improve patients survival and disease prognostic. Hence, sensitive and specific
methods ought to be developed and improved towards this purpose. The use of aptamers as
bioreceptors in the design of electrochemical aptasensors has offered new prospects in diagnostic
assays in the areas of protein disease biomarkers detection.
In this thesis, the possibility of using an electrochemical aptamer-based biosensor for the detection
of osteopontin (OPN) has been studied. Aptamers are artificial oligonucleotides (DNA or RNA) that
bind their targets with high affinity and specificity. OPN is a glycoprotein present in many tissues and
body fluids that is considered a potential biomarker for breast cancer. Initially, an RNA aptamer
against OPN, previously reported, was used as the bioreceptor element in the design of an
aptasensor. The OPN-binding RNA aptamer was immobilized onto a screen printed gold electrode
through a biotin-streptavidin interaction. The electrochemical RNA aptasensor showed a good
sensitivity to human OPN and for thrombin (a protein commonly found in human serum). Thus, other
specific bioreceptors that could enable the selective detection of human OPN were selected. A DNA
aptamer was isolated through the SELEX methodology. This aptamer was characterized by
fluorescence assays and presented a good affinity to OPN, thus it was used as the bioreceptor in the
design of a new electrochemical DNA aptasensor. This aptasensor exhibited a better performance
regarding the sensitivity and selectivity for the detection of human OPN as compared to the above
mentioned RNA aptasensor that used the same electrode surface, immobilization method and
voltammetry techniques. Finally, these two aptamers (DNA and RNA) were used to develop a labelfree
aptasensor array that could simultaneously detect OPN using a dual-screen printed gold
electrode. In conclusion, the electrochemical aptasensors herein developed can be an alternative to
the standard methods currently used to detect/quantify protein disease biomarkers and could be a
useful tool in the diagnosis of breast cancer disease.Este trabalho apresentado nesta tese foi apoiada financeiramente por uma bolsa de doutoramento
(Ref.ª SFRH / BD / 65021/2009) da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) e do Fundo
Social Europeu (POPHQREN), o Projeto FCT Estratégico UID/BIO/04469/2013 unidade, o projeto
RECI/certificação-EBI/0179/2012 (FCOMP-01-0124-FEDER-027462) e do Projeto "BioInd –
“Biotechnology and Bioengineering for improved Industrial and Agro-Food processes”, REF. NORTE-
07-0124-FEDER-000028, co-financiado pelo Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 - O
Novo Norte), QREN, FEDER.O cancro da mama é o mais frequente entre mulheres em todo o mundo, a sua mortalidade está
associada ao desenvolvimento de metástases do tumor primário. Atualmente, é a quinta causa de
morte por cancro (522.000 mortes), tendo sido diagnosticados cerca de 1,67 milhões de novos
casos em 2012. O diagnóstico precoce é crucial para aumentar a taxa de sobrevivência e sucesso
do prognóstico. Neste sentido, urge o desenvolvimento de métodos sensíveis e específicos para
melhorar o diagnóstico precoce. O uso de aptâmeros, como elementos de reconhecimento biológico
no desenho de biossensores eletroquímicos ( aptasensors), tem oferecido novas perspetivas de
diagnóstico em particular nas áreas de deteção de proteínas associadas ao cancro (biomarcadores).
Nesta tese, avaliou-se a possibilidade de usar um biossensor eletroquímico, baseado em aptâmeros,
para a deteção da osteopontina humana (OPN). A OPN é uma glicoproteína presente em muitos
tecidos e fluidos corporais, sendo considerada um potencial biomarcador do cancro da mama. Os
aptâmeros são ácidos nucleicos artificiais de cadeia simples (ADN ou ARN) que reconhecem e se
ligam com elevada afinidade e especificidade aos seus alvos. Inicialmente, um aptâmero de ARN
específico para a OPN, descrito na literatura, foi utilizado como elemento de reconhecimento no
desenvolvimento de um “ aptasensor”. O aptâmero foi imobilizado num elétrodo de ouro através de
uma interação biotina-estreptavidina. O biossensor eletroquímico, baseado no aptâmero de ARN,
apresentou boa sensibilidade para OPN humana e para trombina (proteína presente no soro
humano). Nesse sentido, selecionou-se outro aptâmero de ADN com maior especificidade e
seletividade para a OPN humana usando para o efeito a metodologia SELEX. Este aptâmero ADN foi
então usado no desenvolvimento de um novo biossensor eletroquímico. Este novo biossensor
apresentou melhor sensibilidade e seletividade para a OPN humana comparativamente com o
anteriormente referido, utilizando a mesma superfície de elétrodo, método de imobilização e técnicas
voltamétricas. Finalmente, um multi-biossensor foi desenvolvido usando os dois aptâmeros (ADN e
ARN) para detetar simultaneamente a OPN humana. Em conclusão, os biossensores electroquímicos
desenvolvidos podem ser uma alternativa aos métodos convencionais utilizados para
detetar/quantificar biomarcadores, bem como uma ferramenta útil para o diagnóstico precoce do
cancro da mama
