Tese de Doutoramento em Ciências da SaúdeIncreased life expectancy contributed to a marked increase in aging-associated maladies. Among
those, we can find dementias, which are often accompanied by neurodegeneration and behavioral
alterations, and may culminate in a loss of independence and autonomy. Alzheimer's disease (AD)
represents the most prevalent form of age-associated dementia and is characterized by severe
memory loss and cognitive deficits. This neurodegenerative disease exists as either a less common,
early-onset, autosomal dominant familial form and a more prevalent, late-onset, sporadic form. Yet,
both types of AD are characterized by common brain pathological hallmarks, namely the presence of
extracellular senile plaques, which are highly enriched in different forms of aggregated amyloid beta
(Aβ) peptides, and of intracellular neurofibrillary tangles, that result from the aggregation of
hyperphosphorylated Tau protein. The discoveries made in the past two decades shed some light on
the mechanisms that trigger neuroinflammation, cellular dysfunction and brain pathology, as well as
their role as mediators of behavioral alterations, in AD. However, certain aspects of the disease are
still poorly understood and are, sometimes, controversial.
This thesis emerged with the objective of using different models to explore the role of novel and
promising cellular and molecular targets in the context of aging and AD. Initially, we focused on the
role of the protein lipocalin 2 (LCN2), which is closely involved in the innate immune response and
in iron metabolism, two different mechanisms that can equally modulate the amyloidogenic pathway
and Aβ toxicity in AD. Herein, we show that LCN2 is overproduced both in vitro and in vivo by
specific brain cell types, namely choroid plexus (CP) epithelial cells and astrocytes, in response to
Aβ1-42 peptides. Importantly, we show that the overexpression of iron metabolism and innate-like
proinflammatory genes, as well as the marked astrogliosis, observed in response to the toxic levels
of Aβ1-42, are ablated in the absence of LCN2. These results point to a role of LCN2 in the
modulation of Aβ-induced toxicity and prompt for further investigation regarding the impact of LCN2
on brain pathology and behavior impairment in AD.
Next, taking into account the important function of the brain barriers in the maintenance of central
nervous system (CNS) homeostasis in health and in disease, we analyzed the response at the level
of the blood-cerebrospinal fluid (CSF) barrier, formed by the CP cells, in AD. For that, we took
advantage of an AD transgenic mouse model, the PDGFB-APPSwInd (J20) mice, which overexpress
the human gene for amyloid precursor protein (APP) with two mutations that favor its amyloidogenic processing and an increased formation of Aβ peptides. Specifically, we analyzed the response in the
CP of J20 mice and of age matched wild-type (WT) littermate controls at 3, 5-6 and 11-12 months.
By microarray analysis, we found that aging influences different gene pathways in the CP of 11-12
months-old mice, such as the ones involved in the regulation of the cellular circadian cycle, transport
of nutrients and lipid metabolism. These alterations support the idea that there is a clear dysfunction
of the CP with aging, which impacts on the production of CSF and on the integrity of the blood-CSF
barrier. Strikingly, we found an early overexpression of genes implicated in the type I interferon (IFN)
response and a decreased expression of the gene encoding for IFN-γ, the major type II IFN cytokine,
at later ages, in the CP of J20 mice when compared to age-matched WT mice. Trying to figure out
the extent of these changes, we also investigated the response in the brain parenchyma, namely in
the dorsal hippocampus (dHPC), and in the periphery, particularly in the liver. Interestingly, the
manifestation of deficits in spatial reference-memory by J20 mice, at 3 months, and by WT mice, at
11-12 months, was accompanied by an increased expression of type I IFN genes in the dHPC.
Noticeably, we observed a significant correlation between the levels of IFN-α in the CSF and the
performance in a memory-dependent task. Regarding the responses in the brain and in the
periphery, we found a similar pattern of type II IFN gene expression in the CP and in the liver of J20
mice. However, with aging, there was an overexpression of type I IFN genes and a decrease in the
number of perivascular Aβ-loaded macrophages in the liver of J20 mice. These observations suggest
that changes in the levels of different types of IFNs may influence the deposition and/or clearance of
Aβ, as well as memory and cognition.
Altogether, the work presented here highlights some important functions and effects of different
types of inflammatory molecules, such as LCN2 and IFNs, in the context of neurodegeneration and
of behavioral alterations in AD, opening new doors for future research in the field.O aumento da esperança média de vida contribuiu para um aumento acentuado das doenças
associadas ao envelhecimento. Entre essas, podemos encontrar as demências, que são muitas
vezes acompanhadas por neurodegeneração e alterações comportamentais, e poderão culminar
numa perda de independência e autonomia. A Doença de Alzheimer (DA) representa a forma mais
prevalente de demência associada ao envelhecimento, e é caracterizada por perda de memória e
défices cognitivos acentuados. Esta doença neurodegenerativa pode manifestar-se numa forma
autossómica dominante menos comum, de início precoce, ou numa forma esporádica mais
comum, de início tardio. No entanto, ambas as formas de DA são caracterizadas por marcas
patológicas cerebrais comuns, nomeadamente a presença de placas senis extracelulares, ricas em
péptidos beta-amiloide (Aβ) em diferentes estados de agregação, e emaranhados neurofibrilares
intracelulares, resultantes da agregação da proteína Tau hiperfosforilada. As descobertas realizadas
nas últimas duas décadas contribuiram para uma melhor compreensão dos mecanismos que
desencadeiam neuroinflamação, disfunção celular e patologia cerebral, assim como o seu papel
como mediadores de alterações comportamentais, na DA. No entanto, alguns pormenores acerca
da doença não são ainda completamente claros, sendo até, por vezes, controversos.
Esta tese surgiu com o objetivo de utilizar modelos diferentes para explorar o papel de alvos
celulares e moleculares novos e promissores no contexto do envelhecimento e da DA. Inicialmente,
focámo-nos no papel da proteína lipocalina 2 (LCN2), que está intimamente envolvida na resposta
imune inata e no metabolismo do ferro, dois mecanismos diferentes que estão envolvidos na
modulação da via amiloidogénica e da toxicidade da Aβ na DA. Neste trabalho, mostramos que a
LCN2 é produzida em maior quantidade, tanto in vitro como in vivo, por certos tipos de células
cerebrais, nomeadamente por células epiteliais do plexo coroide (CP) e astrócitos, em resposta a
péptidos Aβ1-42. É importante salientar que os níveis de expressão de genes do metabolismo do
ferro e da resposta pró-inflamatória inata, assim como a astrogliose acentuada, observados em
resposta a níveis tóxicos de Aβ1-42, estão reduzidos na ausência de LCN2. Estes resultados apontam
para um papel da LCN2 na modulação da toxicidade induzida por péptidos Aβ e para a necessidade
de aprofundar a investigação acerca do impacto da LCN2 na patologia cerebral e défices
comportamentais na DA. De seguida, tendo em conta a importante função das barreiras do cérebro na manutenção da
homeostasia do sistema nervoso central (SNC) na saúde e na doença, analisámos a resposta ao
nível da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (LCR), formado pela células do CP, na DA. Nesse
sentido, utilizámos um modelo da DA, os ratinhos transgénicos PDGFB-APPSwInd (J20), que sobreexpressam
o gene humano que codifica a proteína precursora da amiloide (APP) com duas
mutações que favorecem o seu processamento pela via amiloidogénica e um aumento da formação
de péptidos Aβ. Especificamente, analisámos a resposta no CP de ratinhos J20 e do tipo selvagem
(WT), da mesma idade e ninhada, aos 3, 5-6 e 11-12 meses. Através da análise por microarray,
descobrimos que o envelhecimento influencia genes de vias diferentes no CP de ratinhos com 11-
12 meses de idade, nomeadamente as que estão envolvidas na regulação do ciclo circadiano
celular, transporte de nutrientes e metabolismo de lípidos. Estas alterações apoiam a ideia de que
há uma clara disfunção do CP com o envelhecimento, e que esta tem um impacto sobre a produção
de LCR e sobre a integridade da barreira sangue-LCR. Surpreendentemente, descobrimos uma
sobre-expressão precoce de genes envolvidos na resposta de interferão (IFN) do tipo I e uma
diminuição da expressão do gene que codifica IFN-γ, a principal citocina de IFN tipo II, em idades
posteriores, no CP de ratinhos J20 em comparação com ratinhos WT da mesma idade. Numa
tentativa de descobrir a extensão destas alterações, também investigámos a resposta no
parênquima cerebral, nomeadamente no hipocampo dorsal (dHPC), e na periferia, particularmente
no fígado. Curiosamente, a manifestação de défices de memória por ratinhos J20, aos 3 meses, e
por ratinhos WT, aos 11-12 meses, foi acompanhada por um aumento da expressão de genes de
IFN tipo I no dHPC. Notavelmente, observámos uma correlação significativa entre os níveis de IFN-α
no LCR e o desempenho numa tarefa dependente da memória. Relativamente às respostas no
cérebro e na periferia, encontrámos um padrão semelhante de expressão de genes de IFN tipo II no
CP e no fígado de ratinhos J20. No entanto, com o envelhecimento, houve uma sobre-expressão de
genes de IFN tipo I e uma diminuição no número de macrófagos perivasculares positivos para Aβ no
fígado de ratinhos J20. Estas observações sugerem que alterações nos níveis de diferentes tipos de
IFNs podem influenciar a deposição e/ou a excreção de Aβ, bem como a memória e cognição.
No seu todo, o trabalho aqui apresentado destaca importantes funções e efeitos de diferentes
moléculas inflamatórias, como a LCN2 e os IFNs, no contexto da neurodegeneração e das
alterações comportamentais na DA, abrindo novas portas para futura investigação na área