Tese de doutoramento em Ciências da Saúde.Ataxin-3 (ATXN3) is the protein involved in Machado-Joseph Disease (MJD), one of the nine
neurodegenerative disorders known to be caused by a polyglutamine (polyQ) expansion. This polyQ tract causes
the appearance of misfolded protein species, protein aggregates, neuronal dysfunction and cell death. ATXN3 is
known to interact with polyubiquitin chains and to have deubiquitylating (DUB) activity in vitro, but its substrates
and its cellular and physiological role(s) remain unknown, specially in neurons. Since the leading hypothesis
concerning the pathogenesis of MJD is that the expanded polyQ tract confers a toxic gain of function of ATXN3, not
much attention has been dedicated to its normal function. However, it is believed that a partial loss of the normal
function of ATXN3 may also contribute to and modulate disease progression. This study was based on the idea that
understanding the normal physiological role of ATXN3 will be of relevance for our understanding of the
pathogenesis of MJD.
In this work, we explored the function of ATXN3 in neuronal cells and its perturbation in the context of MJD. We
found that ATXN3 is required for neuronal differentiation and for normal cellular morphology, cytoskeleton
organization, proliferation and survival. This phenotype is associated with increased proteasomal degradation of
alpha5-integrin subunit (ITGA5) and reduced activation of integrin signaling. Interestingly, we show that silencing of
ATXN3, overexpression of a catalytically inert version of the protein or a mutant protein bearing an expanded polyQ
tract led to partially overlapping phenotypes, suggesting that a loss of the neuronal function of ATXN3 may be
contributing to neurodegeneration. Consistent with a wider role of ATXN3 in the regulation of the cytoskeleton network, we found that loss of
function of ATXN3 also leads to a deregulation of tau expression, namely a deregulation of tau exon 10 splicing.
This event has a negative impact in neuronal morphology and differentiation. Additionally, we found that ATXN3
interacts with SFRS7, a regulator of tau splicing, and regulates its ubiquitylation levels. As similar alterations were
found in the brain of a mouse model of MJD, it is likely that this mechanism is contributing to pathogenesis of this
disorder. Hence, this work establishes for the first time a functional link between two key proteins involved in
different neurodegenerative diseases.
Lastly, we characterized the ubiquitome of neuronal cells lacking ATXN3 in an attempt to identify potential
substrates of its DUB activity. We found that a large proportion of these proteins were involved in RNA posttranscriptional
modification. Considering this, we analyzed by transcriptomic analysis and using reporter minigenes
the global splicing pattern in neuronal cells upon silencing of ATXN3 and found that splicing was globally altered in
these cells. These findings lead us to propose for the first time that ATXN3 plays a role in splicing regulation in
neurons, a novel function for this protein.
In summary, this work adds new knowledge about the relevance for neurons of one specific DUB, ataxin-
3, and provides new clues about its biological functions and the pathways in which it is involved. It reinforces
ATXN3’s involvement with the UPP and it also raises new hypotheses for its role in cytoskeleton organization and in
splicing regulation. Additionally, it provides evidence for perturbation of the normal function of ATXN3 in the context
of disease, through a dominant negative effect, which may have relevance for the development of future
therapeutical strategies.A Ataxina-3 (ATXN3) é a proteína envolvida na Doença de Machado-Joseph (DMJ), uma das nove doenças
neurodegenerativas que se sabe serem causadas por uma expansão de poliglutaminas (poliQ). Este trato de poliQ
causa o aparecimento de espécies proteicas com uma conformação anormal, agregados proteicos, disfunção
neuronal e morte celular. A ATXN3 interage com cadeias de poliubiquitina e tem atividade de ubiquitina hidrolase
(DUB) in vitro, mas os seus substratos e a(s) sua(s) função(ões) fisiológica(s) permanecem desconhecidos,
especialmente em neurónios. Dado que a hipótese actualmente mais aceite relativa ao mecanismo patogénico da
DMJ considera que o trato de poliQ expandido confere um ganho tóxico de função à ATXN3, não tem sido
dedicada muita atenção à sua função normal. Contudo, acredita-se que a perda parcial da função normal da
ATXN3 também pode contribuir e modular a progressão da doença. Este estudo baseou-se na ideia de que
conhecer a função fisiológica normal da ATXN3 será relevante para conseguirmos compreender a patogénese da
doença. Neste estudo, explorámos a função da ATXN3 em neurónios e a sua perturbação pela expansão poliQ em
DMJ. Descobrimos que a ATXN3 é necessária para a diferenciação neuronal e para a normal morfologia celular,
organização do citosqueleto, proliferação e sobrevivência. Este fenótipo está associado a um aumento da
degradação da subunidade 5-alpha da integrina (ITGA5) pelo proteossoma e uma ativação diminuída da
sinalização pela via das integrinas. Curiosamente, demonstrámos que o silenciamento da ATXN3, a sobreexpressão
de uma versão cataliticamente inerte da proteína ou de uma proteína mutante contendo um trato de
poliQ expandido conduzem a fenótipos parcialmente sobreponíveis, sugerindo que a perda da função neuronal da
ATXN3 pode contribuir para a neurodegeneração. De forma consistente com um papel mais abrangente da ATXN3
na regulação da organização do citosqueleto, descobrimos que a perda de função da ATXN3 também origina uma
desregulação da expressão da tau, nomeadamente uma desregulação do splicing do exão 10 da tau em células
neuronais. Este evento tem um impacto negativo na sua morfologia e diferenciação. Além disso, descobrimos que
a ATXN3 interage com o SFRS7, um factor regulador do splicing da tau, e regula os seus níveis de ubiquitilação.
Considerando que alterações semelhantes foram encontradas no cérebro do modelo de DMJ em ratinho, este
mecanismo parece contribuir para a patogénese. Este trabalho estabelece assim, pela primeira vez, uma ligação
funcional entre duas proteínas chave envolvidas em diferentes doenças neurodegenerativas. Por fim,
caracterizámos o ubiquitoma de células neuronais silenciadas para a ATXN3, com o objectivo de identificar
potenciais candidatos para a sua atividade DUB. Concluímos que uma grande proporção destas proteínas estão
envolvidas na modificação pós-transcripcional do RNA. Tendo este dado em consideração, analisámos o padrão
global do splicing por análises de transcriptómica e usando minigenes repórteres, e descobrimos que o splicing
estava globalmente afetado nestas células. Estes achados levaram-nos a propor pela primeira vez que a ATXN3
desempenha um papel na regulação do splicing em neurónios, uma nova função para esta proteína.
Em sumário, este trabalho amplia o conhecimento acerca da relevância para os neurónios de uma DUB
específica, a ataxina-3, e fornece indicativos sobre as suas funções biológicas e as vias celulares onde está
envolvida. Além disso, reforça o envolvimento da ATXN3 com a UPP, levantando também novas hipóteses para o
seu papel na regulação do citosqueleto e na regulação do splicing. Adicionalmente, são apresentadas evidências
para a perturbação da função normal da ATXN3 no contexto da doença através de um efeito dominante negativo,
facto que poderá ser relevante para o desenvolvimento de futuras estratégias terapêuticas.This work was supported by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) and COMPETE through a
Bolsa de Doutoramento (SFRH/BD/51059/2010) and the project (PTDC/SAUGMG/101572/2008) and through National Institutes of Health (NHI) [R01NS038712]
