Almeida, Carina

Azevedo, N. F.

Rocha, Rui

Universidade do Minho: RepositoriUM

A população mundial tem crescido a um ritmo sem prece-dentes, estando estimada atualmente na ordem dos 7 mil mi-lhões de pessoas. Com ela, aumenta também a pressão sobre a produção alimentar. Com efeito estima-se que em 2013 foram produzidas mundialmente 308 milhões de toneladas de carne, 780 milhões de toneladas de leite e derivados, 160 milhões de toneladas de peixe e derivados e 1640 milhões de toneladas de fruta e vegetais1. Destes, um valor no total de 1,15 triliões de dólares (USD) foram gerados por exportação [1, 2]. De facto, nas últimas décadas, com a globalização dos mercados agro-alimentares, tem-se verificado um au-mento do tráfego internacional de géneros alimentares. Estes 2 factos traduzem-se em potenciais problemas de segurança alimentar, quer pela quantidade produzida e/ou transporta-da, quer pelas diferenças nas práticas de segurança alimentar praticadas por cada um dos países de origem dos alimentos.As doenças causadas por patogénios alimentares são um importante problema de saúde pública a nível mundial, re-sultando numa elevada taxa de morbilidade e mortalidade. Atualmente são reconhecidos cerca de 31 patogénios, dos quais Escherichia	coli	patogénica,	Salmonella	spp.,	Staphylo-coccus	aureus,	Listeria	monocytogenes,	Campylobacter	spp.,	Clostridium	spp.,	Sigella	spp. e Yersinia	spp. são os principais responsáveis pela maioria das doenças, hospitalizações e mortes associadas a infeções de origem alimentar [3].Os últimos dados disponibilizados pela Autoridade Europeia de Segurança Alimentar (EFSA), relativos a 2012 estão suma-rizados na tabela 1. Nela é possível observar que o número de casos com mais ocorrências foram as campilobacterioses (infeções causadas por Campylobacter	spp.) e que os casos que se traduziram numa maior taxa de hospitalizações e mortes foram os casos de listeriose (infeções causadas por L.	 monocytogenes) com, respetivamente, 91,6% e 17,8%. Relativamente às colites (infeções causadas por E.	 coli pa-togénicas) o serotipo O157 foi o mais identificado, seguido pelos serotipos O26 e O91 [4]. Em 2012 foram contabiliza-dos cerca de 5 363 surtos alimentares, dos quais 7 tiveram origem em Portugal [4]. Até hoje, o surto alimentar Europeu de 2011 com E.	coli O104:H4 continua a ser o caso mais grave, em grande parte devido aos erros e atrasos na deteção da fonte do surto [5].A prevenção da contaminação de géneros alimentares é de vital importância, dado que uma grande percentagem destes produtos é consumida crua e sem qualquer tratamento pós colheita. A juntar a este facto, existe a possibilidade de con-taminação cruzada de produtos processados e a sua dissemi-nação a nível local, nacional e internacional.Os testes microbiológicos de alimentos foram sempre par-te integrante da produção alimentar, mas eram geralmente empregues em controlos de produto final, que hoje em dia 38Metodologias para a identificação demicrorganismos patogénicos em amostrasalimentares: a técnica de PNA-FISHRui Rocha1,2,3, Carina Almeida1,2,3 e Nuno Filipe Azevedo11LEPABE, Departamento de Engenharia Química, Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, Rua Dr. Roberto Frias, 4200-465 Porto, Portugal 2Centro de Engenharia Biológica, Universidade do Minho, Campus de Gualtar, 4710-057 Braga, Portugal3BIOMODE, Zona Industrial da Gandra, Apartado 4152, 4806-909 Guimarães, PortugalE-mail: nazevedo@fe.up.ptB o l e t i m  d e  B i o t e c n o l o g i a  .  A b r i l  2 0 1 5Doença Área CasosTaxa de hospitalização(%)Taxa de mortalidade(%)CampilobacterioseEUPortugal214 26832847,7-0,03-SalmoneloseEUPortugal91 0347645,1-0,14-ColiteEUPortugal5 671436,5-0,36-ListerioseEUPortugal1 6421291,6-17,8-Tabela 1 - Dados relativos às infeções causadas por patogénios alimentares na Europa em 2012 [4,6]. Apenas os casos mais relevantes (> 1000 casos), confirmados e comunicados à EFSA, foram considerados.1 Dados relativos a 201139B o l e t i m  d e  B i o t e c n o l o g i a  .  A b r i l  2 0 1 5se reconhece como sendo uma estratégia errada. Atualmen-te  encontra-se implementado o sistema Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controlo (APPCC), que mudou o ónus da segurança alimentar dos testes para o controlo do processo de produção [7]. Os testes microbiológicos continuam, no entanto, a ser uma ferramenta fundamental nos processos de controlo e monitorização, visando dois objetivos princi-pais: estabelecer a ausência de agentes patogénios de forma a garantir a segurança dos alimentos e prevenir ou minimi-zar possíveis contaminações ao longo da cadeia alimentar; enumerar a carga microbiana total e deste modo avaliar a eficácia de tratamentos de higiene, a qualidade e a vida útil do produto. Os testes microbiológicos podem ser divididos em métodos convencionais e alternativos.Os métodos convencionais baseiam-se no enriquecimento de culturas seguido de ensaios de confirmação, centrados nas propriedades metabólicas e antigénicas do microrganis-mo a identificar. As principais vantagens da aplicação deste tipo de métodos residem no facto de serem relativamente baratos, tecnicamente simples e apresentarem elevada espe-cificidade e sensibilidade. As desvantagens advêm do facto de serem morosos, laboriosos, propensos a contaminações cruzadas e incapazes de detetar patogénios em baixo núme-ro ou no estado viável não cultivável (isto é, células incapa-zes de crescer nos meios ricos convencionais) [3].Nesse sentido e de forma a acompanhar o processo de pro-dução e distribuição alimentar, há a necessidade de imple-mentar métodos alternativos de deteção que sejam rápidos, sensíveis, fiáveis e versáteis, que possam adaptar-se facil-mente às necessidades das diferentes linhas de produção/processamento de alimentos. Com estas metodologias pro-cura-se reduzir substancialmente o tempo, o trabalho e custo global do processo de deteção. De alguns anos para cá, mui-to trabalho tem sido realizado neste sentido, sendo possível encontrar no mercado diversos métodos rápidos alternativos de testes de patogénio, os que globalmente se incluem nas categorias de testes moleculares e de biossensores [3].Os biossensores são dispositivos analíticos que incorporam elementos biológicos reativos (sondas e/ou anticorpos) na deteção de microrganismos. Estes sistemas são rápidos e per-mitem a análise de diversos tipos de elementos empregando um pequeno volume de amostra. No entanto, a entrada no mercado deste tipo de sistemas tem sido dificultada pela bai-xa sensibilidade, custo elevado aliado a um procedimento complexo e de difícil reprodutibilidade. Adicionalmente, à semelhança de outros métodos moleculares, apresentam li-mitações na deteção em matrizes alimentares complexas [3].Os métodos moleculares podem ser subdivididos em imu-nológicos e os baseados em ácidos nucleicos. Os primeiros baseiam-se na ligação específica entre antigénio e anticorpo, sendo que os segundos (ex: PCR e suas variantes e DNA mi-croarrays) usam parte de sequências de DNA ou RNA espe-cíficas para os microrganismos a identificar, processando-as por amplificação e/ou hibridação. Os métodos moleculares são na generalidade rápidos e robustos. No entanto, enquan-to os métodos imunológicos podem apresentar alguma rea-tividade cruzada com antigénios semelhantes; os métodos baseados em ácidos nucleicos estão dependentes de um passo de amplificação enzimática, que pode ser inibido pela presença de contaminantes [3]. Estes últimos também não permitem distinguir células viáveis de não viáveis e podem necessitar de passos adicionais de extração e purificação do DNA.A técnica de hibridação fluorescente in	situ (FISH) é também uma metodologia que nos últimos anos tem sido desenvol-vida para aplicação a testes microbiológicos de controlo ali-mentar. Esta consiste basicamente no uso de sondas oligonu-cleotídicas marcadas com fluorescência que hibridam com regiões complementares dos ácidos nucleicos de microrga-nismos, geralmente RNA ribossomal (rRNA). O método as-senta em 4 passos, fixação e permeabilização da amostra, hi-bridação da sonda com a sequência de rRNA alvo, lavagem (que visa a extração de sonda não hibridada) e finalmente, a observação da amostra ao microscópio de fluorescência ou a sua deteção por citometria de fluxo [8]. Nos trabalhos de FISH, no passo de hibridação, é comum usar uma sonda de DNA ou RNA, que atribuem algumas limitações à metodo-logia, como baixa robustez e passo de hibridação moroso. A utilização de mímicos de ácidos nucleicos, como o ácido péptido nucleico (PNA), permite ultrapassar algumas destas limitações. O PNA é uma poliamina com uma estrutura neu-tral composta por unidades de glicina N-(2-aminoetil) ao in-vés de pentoses e grupos fosfato da molécula de DNA. Esta composição confere, comparativamente às sondas de DNA, várias vantagens, nomeadamente a falta de repulsão electro-estática e uma superior estabilidade dos duplexos de PNA/DNA, resultando numa maior especificidade. Por fim as son-das de PNA permitem uma maior acessibilidade ao material genético alvo, dado que a hibridação é realizada sob baixa concentração de sal, promovendo a destabilização das es-truturas secundárias do rRNA. Isto traduz-se numa etapa de hibridação muito rápida [8].A técnica de PNA-FISH oferece portanto uma maior especi-ficidade, estabilidade e rapidez que outros métodos mole-culares. Para além disso, e ao contrário de outros métodos baseados em ácidos nucleicos, não é afetada pela presença de inibidores e só deteta microrganismos com um conteúdo ribossomal estável, em teoria, viáveis.Figura 1 – Kit Probe4Salmonella desenvolvido pela Biomode S. A. para a de-teção de Salmonella	spp.B o l e t i m  d e  B i o t e c n o l o g i a  .  A b r i l  2 0 1 5As desvantagens desta metodologia podem residir na inexis-tência de um passo único de fixação e permeabilização, sen-do necessário adaptar tento em conta o microrganismo alvo. Adicionalmente, a identificação dos microrganismos tendo por base as sequências de rRNA, pode gerar problemas em encontrar uma sequência que consiga discriminar microrga-nismos evolutivamente próximos.Nesse sentido, os nossos esforços de investigação tem-se focado, desde 2001, na exploração dos mímicos de áci-dos nucleicos, nomeadamente as sondas de PNA, e na sua aplicabilidade ao protocolo de FISH. O desenvolvimento, com sucesso, de métodos de PNA-FISH específicos para a deteção de patogénios alimentares, como Cronobacter, na origem de graves infeções com elevada taxa de mortalidade em recém-nascidos pelo consumo de fórmula infantil em pó contaminada [9], Salmonella	spp. [10,11] ou E.	coli O157:H7 [12]; resultou numa evolução natural para aplicações comer-ciais (ex.: 2 pedidos de patente internacionais para a apli-cação do método de PNA-FISH em Salmonela	 spp., PCT/IB2011/051337, e E.	 coli O157:H7, PCT/PT2014/000023). Esta tecnologia, e subsequentes aplicações à área da segu-rança alimentar, estiveram na base da criação da empresa Biomode S.A.. As aplicações baseadas em PNA-FISH que neste momento se encontram a iniciar o processo de certi-ficação internacional, poderão em breve alargar o leque de soluções moleculares existentes no mercado, contribuindo para um melhor rastreio do processo produtivo e prevenção das infeções alimentares (Figura 1).AgradecimentosEste trabalho foi financiado por Fundos FEDER através do Pro-grama Operacional Factores de Competitividade – COMPETE, através do Programa Operacional do Norte (ON2) e por Fun-dos Nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito dos projetos PEst-C/EQB/UI0511, NOR-TE-07-0124-FEDER-000025 - RL2_ Environment&Health e Projeto “DNA mimics” PIC/IC/82815/2007; Bolsa de Dou-toramento SFRH/BDE/51910/2012 e Bolsa de Pós-Doutora-mento SFRH/BPD/74480/2010.Referências[1] FAO, Food and Agriculture Organization of the United Nations. 2013.  FAO food outlook, biannual report on global food markets November  2013, FAO Publishing[2] FAO, Food and Agriculture Organization of the United Nations. 2014.  FAO statistical yearbook 2014, Near East and North Africa Food and Agri-  culture, FAO Publishing[3] Yeni, F., Acar, S., Polat, Ö. G., Soyer, Y. e Alpas, H. 2014. Rapid and  standardized methods for detection of foodborne pathogens and mycoto-  xins on fresh produce. Food Control, 40:359-367[4] EFSA, European Food Safety Authority. 2014. The European Union Sum-  mary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and  Food-borne Outbreaks in 2012. Parma, Itália: EFSA Journal, 12:3547[5] WHO, World Health Organization. 2011. A public health review of the  enterohemorrhagic Escherichia	coli outbreak in Germany 9[6] EFSA, European Food Safety Authority. Portugal - 2012 Report on trends  and sources of zoonoses. Parma, Itália[7] FAO⁄WHO, Food and Agriculture Organization of the United Nations/  World Health Organization. 2003. Hazard Characterization for Patho-  gens in Food and Water: Guidelines. Microbiological Risk Assessment  Series No. 3. Roma, Italia[8] Cerqueira, L., Azevedo, N. F., Almeida, C., Tatiana, J., Keevil, C. W. and  Vieira, M. J. 2008. DNA Mimics for the Rapid Identification of Microor-  ganisms by Fluorescence in	situ Hybridization (FISH). International Jour- nal of Molecular Sciences, 9:1944-1960[9] Almeida, C., Azevedo, N. F., Iversen, C., Fanning, S., Keevil, C. W. e  Vieira, M. J. 2009. Development and Application of a Novel Peptide  Nucleic Acid Probe for the Specific Detection of Cronobacter Genomos- pecies (Enterobacter	sakazakii) in Powdered Infant Formula. Applied and Environmental Microbiology, 75:2925-2930[10] Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W. e Vieira,  M. J. 2010. Fluorescence In	Situ Hybridization Method Using a Peptide Nucleic Acid Probe for Identification of Salmonella	spp. in a Broad Spec- trum of Samples. Applied and Environmental Microbiology, 76:4476-4485[11] Almeida, C., Cerqueira, L., Azevedo, N. F. e Vieira, M. J. 2013. Detection  of Salmonella	enterica serovar Enteritidis using real time PCR, immuno- capture assay, PNA FISH and standard culture methods in different types  of food samples. International Journal of Food Microbiology, 161:16-22[12] Almeida, C., Sousa, J. M., Rocha, R., Cerqueira, L., Fanning, S. Azevedo,  N. F. e Vieira, M. J. 2013. Detection of Escherichia	coli O157 by Peptide Nucleic Acid Fluorescence In	Situ Hybridization (PNA-FISH) and Com- parison to a Standard Culture Method. Applied and Environmental Micro-  biology, 79:6293-630040

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