Tese de doutoramento em Engenharia Química e BiológicaHelicobacter pylori is associated with gastric diseases, such as gastritis, peptic and
duodenal ulcers, mucosa associated lymphoid tissue lymphoma and gastric
adenocarcinomas. Despite more than half of the global population being infected with this
bacterium, not all individuals will develop clinical symptoms. Nevertheless, its association
with gastric cancer, the high infection rate, as well as the failures on eradication efforts
and vaccine development lead to an important health concern. In order to better
understand the mechanisms leading to disease and also to develop effective ways to fight
H. pylori infection, it is important to understand its physiological and metabolic behavior.
H. pylori is a microaerophilic, gram negative, fastidious organism, for which no
effective defined medium has been developed. Furthermore, current cultivation procedures
use media that, even when semi-defined, have a variety of nutrients that can be used as
carbon and energy sources. Under those conditions, the metabolic and physiological
characterization of H. pylori is very difficult.
The aim of this work was thus to study the physiology and metabolism of H. pylori
to allow a better understanding of the behavior and pathogenicity of this organism. For that
aim, a systems biology approach was used where Gas Chromatography-Mass
Spectrometry (GC-MS) based metabolomics and genomics data were used to characterize
the nutritional requirements and the preferred carbon sources and to build a reliable
metabolic model.
Data on H. pylori’s exometabolome was for the first time collected from
experiments performed with semi-defined media and allowed to establish the essentiality
of several amino acids: L-histidine, L-leucine, L-methionine, L-valine, L-isoleucine and Lphenylalanine.
Moreover, this analysis indicated that L-aspartate, L-glutamate, L-proline
and L-alanine could be potential carbon sources for H. pylori. Thus, a comparative analysis
of different amino and organic acids as carbon sources was performed and glutamine /
glutamate emerged as the most effective compounds. However, since glutamine is unstable under the conditions used, glutamate was selected the most adequate carbon
source for growing H. pylori.
Then, a simplified medium containing only the essential amino acids and Lglutamate,
besides vitamins and salts, as well as 5% of fetal bovine serum (FBS) was used
to perform physiological studies. Under those conditions, the specific growth rate was
determined to be 0.126 h-1, while the use of uniformly labeled 13C L-glutamate together with
GC-MS measurements of proteinogenic amino acids allowed to confirm the essential
amino acids and raise some clues about L-proline and L-alanine which, given their
presence in FBS, had still unclear roles. L-proline, although not labeled, is probably not
essential and could be obtained from arginine, while L-alanine showed very low labeling
patterns and is hypothesized to originate from pyruvate. Finally, labeling experiments
allowed to confirm the presence of a complete tricarboxylic acid cycle.
These collected data, together with genomics and other information available,
were used to build and validate the first genome-scale metabolic model of H. pylori that is
able to make quantitative predictions, covering roughly 23% of the genome. This model
can be used, in the future, to investigate novel drug targets and elucidate the metabolic
basis of infection.
Furthermore, a comparative study was performed that analyzed different methods
for assessing growth, viability, culturability and morphology, as these are important
physiological parameters.A caracterização fenotípica é de extrema importância para entender o
metabolismo celular, especialmente em organismos patogénicos, para os quais, na sua
maioria, a informação disponível é limitada. Compreender o metabolismo de um
organismo patogénico é fundamental para desvendar os mecanismos de interação
patogénio-hospedeiro, com vista à identificação de alvos para desenvolvimento de
fármacos.
Neste trabalho estudou-se o metabolismo da bactéria Helicobacter pylori, um
micro-organismo patogénico associado a doenças gástricas, usando uma estratégia de
Biologia de Sistemas.
As experiências realizadas usando um meio liquido semi-definido para crescer H.
pylori provaram a existência de um fator de stress associado a uma paragem do seu
crescimento, acompanhada de uma mudança de morfologia. Sendo conhecido o caracter
pleiomórfico da H. pylori quando sujeita a determinadas condições de stress, e dado que
os requisitos nutricionais não se encontravam completamente definidos, foi levantada a
hipótese deste fator de stress estar associado à falta de um nutriente essencial. Assim, foi
efetuada uma análise de exometaboloma com vista a determinar os seus requisitos
nutricionais e preferências. Verificou-se a existência de aminoácidos essenciais ao
crescimento, e comprovou-se a preferência dos aminoácidos como fonte de carbono
(glutamato, prolina, alanina e aspartato). No entanto, algumas dúvidas persistiram
relativamente à essencialidade de prolina e alanina.
Para identificar a fonte de carbono preferencial foram testados diversos
aminoácidos. Identificou-se que o aminoácido L-glutamato é o mais indicado ao
crescimento de H. pylori, tendo-se efetuado a caracterização do seu crescimento com o
referido aminoácido como fonte de carbono.
Como forma de comprovar a efetiva utilização de L-glutamato como fonte de
carbono, foram efetuadas experiências com 13C L-glutamato, tendo-se utilizado
cromatografia gasosa com espectroscopia de massas para a análise das amostras. A análise dos aminoácidos do hidrolisado de biomassa de H. pylori permitiu comprovar a
utilização de L-glutamato como fonte de carbono. Comprovou-se ainda a essencialidade
dos aminoácidos isoleucina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina e valina. Foi possível
também identificar algumas vias metabólicas ativas para as quais residiam dúvidas, como
o caso da existência do ciclo de Krebs completo. As experiências realizadas permitiram
ainda levantar hipóteses acerca da biossíntese de L-prolina e L-alanina em H. pylori a
partir de L-arginina e piruvato, respetivamente.
Com a informação recolhida, associada à anotação do genoma recentemente
efetuada foi possível reconstruir um modelo metabólico à escala genómica para H. pylori
26695. As previsões obtidas com o referido modelo estão de acordo com os dados
experimentais. Este modelo contém informação biológica relevante para este organismo,
com possível aplicação na identificação de potenciais alvos metabólicos, para a obtenção
de fármacos mais efetivos na erradicação de H. pylori.Research Grant SFRH/BD/47596/2008 financed by FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia). This work was supported in part by the ERDF - European Regional Development Fund thought the COMPETE Programme (operational programme for competitiveness), and National Funds through the FCT within the project FCOMP-01-0124-FEDER-009707 (HeliSysBio-molecular Systems Biology in Helicobacter pulori)