A necessidade de aumentar a oferta de energia líquida e limpa na matriz
energética mundial possibilita a produção de etanol como uma solução emergente e
eficaz. Neste contexto, o objetivo desse trabalho consiste em analisar a hidrólise
enzimática dos materiais lignocelulósicos pré-tratados (10 % p/v) e a fermentação e
sacarificação simultânea (SSF) pela levedura floculante e termotolerante
Saccharomyces cerevisiae CA11. As hidrólises enzimas apresentaram conversões dos
materiais lignocelulósicos em glicose entre 75 a 85 %. A SSF realizada pela S.
cerevisiae CA11 sob a fibra de coco maduro pré-tratada hidrotermicamente catalisada
com hidróxido de sódio resultou em produção e rendimento de etanol de 25.83 g/L e
0.46 g/g, respectivamente. Dessa forma, os resultados obtidos sinalizam a possibilidade
benéfica de utilizar esses materiais lignocelulósicos pré-tratados e a S. cerevisiae CA11
na produção de etanol celulósico

Gonçalves, F. A.

Macedo, G. R.

Ruíz, Héctor A.

Santos, E. S. dos

Teixeira, J. A.

Universidade do Minho: RepositoriUM

 XIX SIMPÓSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS X SIMPÓSIO DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE BIOMASSAS  30 de julho-02 de agosto de 2013 Foz de Iguaçu, PR, Brasil       HIDRÓLISE ENZIMÁTICA, SACARIFICAÇÃO E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEA DE MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS USANDO SACCHAROMYCES CEREVISIAE CA11    F. A. GONÇALVES 1,2, H. A. RUIZ 2,3, E. S. DOS SANTOS 1, J. A. TEIXEIRA 2, G. R. MACEDO1   1Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Departamento de Engenharia Química 2Universidade do Minho, Departamento de Engenharia Biológica 3Universidade Autônoma de Coahuila, Departamento de Pesquisa Alimentar E-mail: fabiano_avelinogoncalves@yahoo.com.br  RESUMO – A necessidade de aumentar a oferta de energia líquida e limpa na matriz energética mundial possibilita a produção de etanol como uma solução emergente e eficaz. Neste contexto, o objetivo desse trabalho consiste em analisar a hidrólise enzimática dos materiais lignocelulósicos pré-tratados (10 % p/v) e a fermentação e sacarificação simultânea (SSF) pela levedura floculante e termotolerante Saccharomyces cerevisiae CA11. As hidrólises enzimas apresentaram conversões dos materiais lignocelulósicos em glicose entre 75 a 85 %. A SSF realizada pela S. cerevisiae CA11 sob a fibra de coco maduro pré-tratada hidrotermicamente catalisada com hidróxido de sódio resultou em produção e rendimento de etanol de 25.83 g/L e 0.46 g/g, respectivamente. Dessa forma, os resultados obtidos sinalizam a possibilidade benéfica de utilizar esses materiais lignocelulósicos pré-tratados e a S. cerevisiae CA11 na produção de etanol celulósico.   1. INTRODUÇÃO A utilização de biocombustíveis surge como alternativa de mitigar a pressão exercida pelos combustíveis fósseis e seus derivados, com destaque do etanol. Entretanto, o etanol produzido a partir do amido de milho, sacarose da cana-de-açúcar e beterraba, podem futuramente ocorrer numa conjuntura que configure competição entre a utilização desses materiais para produção de bioenergia ou alimentação (Gonçalves et al., 2011). Uma opção consiste na produção de etanol celulósico a partir do aproveitamento de vegetais cultivados em locais inóspitos, resíduos agroindustriais e urbanos de origem vegetal, que permitirá elevada abrangência geográfica, aumento significativo na oferta de energia limpa e aumento na produção de etanol sem a necessidade de expansão no uso de terras agricultáveis (Gonçalves et al., 2011).  A utilização de levedura floculante torna-se uma alternativa promissora para a produção de etanol celulósico. Sendo a floculação um processo reversível, assexual e de agregação de células de leveduras em massas multicelulares com rápida sedimentação (Zhao e Bai, 2009). Promove assim, a redução de custos de tratamento downstream, resistência à contaminação microbiana, menor sensibilidade ao estresse provocado pela concentração de etanol e compostos inibitórios (Verstrepen et al., 2003; Zhao e Bai, 2009). Além de possibilitar o reciclo celular em hidrolisado que possui material lignocelulósico pré-tratado com baixo teor de lignina. Dessa forma, este trabalho objetiva avaliar a hidrólise enzimática e produção de etanol pela levedura floculante e termotolerante S. cerevisiae CA11 em materiais lignocelulósicos pré-tratados.     XIX SIMPÓSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS X SIMPÓSIO DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE BIOMASSAS  30 de julho-02 de agosto de 2013 Foz de Iguaçu, PR, Brasil       2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Materiais Os materiais lignocelulósicos utilizados foram o cacto, casca de coco verde, fibra de coco maduro e a casca de coco maduro pré-tratados por peróxido de hidrogênio seguido de hidróxido de sódio, autohidrólise, hidrotérmico catalisado com hidróxido de sódio e organosolv. Os melhores materiais lignocelulósicos de acordo com cada pré-tratamento são apresentados na Tabela 1 e foram utilizados na hidrólise enzimática e SSF.  Tabela 1. Composição dos materiais lignocelulósicos  Pré-tratamento Material lignocelulósico Glicose (%) Hemicelulose (%) Lignina Klason (%) Cinzas (%)Fibra de coco maduro 32.18 27.81 25.02 3.31Casca de coco maduro 29.58 27.76 31.04 4.84Casca de coco verde 33.23 29.14 25.44 4.34Cactos 38.12 23.50 19.51 6.64Autohidróliseb Casca de coco verde 41.97 8.08 41.29 1.22Hidrotérmico catalisado com hidróxido de sódioc Fibra de coco maduro 56.44 12.59 13.52 8.30Organosolv d Cactos 72.67 7.71 4.60 9.20Peróxido de hidrogênio seguido de hidróxido de sódioa Fibra de coco maduro 51.80 25.81 8.83 2.98In natura a 2.2. Hidrólise enzimática  A etapa de hidrólise enzimática foi realizada utilizando o kit enzimático Cellic CTec 2 e HTec 2 (Novozymes, Denmark). A carga enzimática utilizada foi de: 30 FPU; 75 CBU e 130 xilanases por grama de material lignocelulósico (Mandels et al., 1976; Miller, 1959; Leite et al., 2007).  A hidrólise enzimática foi realizada com 10 % (p/v) de material lignocelulósico pré-tratado e 48 mL de tampão de citrato de sódio a 50 µM (pH 5.0) em frascos Erlenmeyer de 250 mL, acondicionado a 50 °C, agitação de 150 rpm, durante 96 h (Dowe e McMillan, 2001; Gouveia et al., 2010). Todas as determinações foram realizadas em duplicata. 2.3. Micro-organismos A S. cerevisiae CA11 foi obtida da coleção microbiana do Laboratório de Fisiologia de Micro-organismo da Universidade Federal de Lavras. A linhagem foi mantida em placas com ágar formulada por extrato de levedura (10 g/L), peptona (20 g/L), ágar (20 g/L) e glicose (20 g/L), a 4 °C. Preparo do inóculo: O inóculo foi cultivado em frascos Erlenmeyer de 250 mL, contendo 100 mL de meio de cultivo contendo glicose (50 g/L), peptona (10 g/L), extrato de levedura (10 g/L), sulfato de amônia (1 g/L), fosfato de potássio (0.5 g/L) e sulfato de magnésio (0.25 g/L) (Gouveia et al., 2010) e o cultivo realizado em pH 5.0, acondicionado a 200 rpm e 42 °C, durante 12 h. 2.4. Processo de fermentação e sacarificação simultânea (SSF) A SSF foi realizada com 10 % (p/v) de material lignocelulósico pré-tratado e 48 mL de tampão de citrato de sódio a 50 mM (pH 5.0) em frascos Erlenmeyer de 250 mL, suplementado com sulfato de amônia (1 g/L), fosfato de potássio (0.5 g/L), sulfato de magnésio (0.25 g/L), extrato de levedura (2 g/L) e peptona (1 g/L) (Dowe e McMillan, 2001; Gouveia et al., 2010). A biomassa microbiana inoculada foi equivalente a densidade óptica de 2.0 em λ de 600 nm, acondicionado a 200 rpm, a 42 °C, durante 60 h. Todas as determinações foram realizadas em duplicata.  2.5. Métodos analíticos  As amostras foram centrifugadas e filtradas para quantificação dos carboidratos e etanol. A separação cromatográfica foi realizada utilizando a coluna Metacarb 87 H (300x7.8 mm, Varian,  XIX SIMPÓSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS X SIMPÓSIO DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE BIOMASSAS  30 de julho-02 de agosto de 2013 Foz de Iguaçu, PR, Brasil       USA) sob a seguinte condições: fase móvel 5 µM H2SO4, fluxo de 0.7 mL/min e temperatura da coluna de 60 °C. O CLAE usado foi da Jasco (Jasco, Japan).  As conversões de glicose e etanol foram realizadas de acordo com Dowe e McMillan (2001). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO A maior conversão de glicose ocorreu em fibra de coco maduro pré-tratada pelo processo hidrotérmico catalisado com hidróxido de sódio (84.49 %), seguido pela fibra de coco maduro pré-tratada por peróxido de hidrogênio seguido de hidróxido de sódio (82.31 %), cactos pré-tratado por organosolv (80.61 %) e casca de coco verde pré-tratada por autohidrólise (75.66 %) (Figura 1 e 2). A SSF foi realizada pela S. cerevisiae sob a fibra de coco maduro pré-tratada pelo processo hidrotérmico catalisado com hidróxido de sódio, a qual apresentou maior conversão em glicose durante a hidrólise enzimática, resultou em produção e rendimento de etanol de 25.83 g/L e 0.46 g/g (Figura 3 e Tabela 2). Esses resultados são similares aos citados na literatura, dessa forma, essa linhagem possui elevado potencial fermentativo em elevada temperatura, sem perder a capacidade floculante. Ruiz et al. (2012), cultivaram essa linhagem a 45 °C sob palha de trigo pré-tratada e resultou em produção de etanol de 14.85 g/L (82.4 % de etanol teórico).  A temperatura é um fator crucial para o processo SSF, sendo necessária a combinação entre as temperaturas ótimas da hidrólise enzimática e do processo fermentativo (Ruiz et al., 2012), além da temperatura afetar diretamente a ecologia microbiana e as reações bioquímicas da levedura (Torija et al., 2003). Neste contexto, os resultados obtidos pela S. cerevisiae demonstram a vantagem de utilizá-la em processos fermentativos, principalmente por ser uma levedura floculante e termotolerante.          Figura 1. Hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos pré-tratados.          Figura 2. Hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos pré-tratados.        Figura 3. Perfil cinético da fermentação de S. cerevisiae CA11 sob a fibra de coco maduro pré-tratada hidrotermicamente catalisada por hidróxido de sódio usando SSF. 0 12 24 36 48 600246810121416182022242628Glucose, xylose and ethanol (g/L)Time (h) Glucose Xylose Ethanol0 12 24 36 48 60 72 84 96020406080100Conversion of glucose (%)Time (h) Autohydrolysis Organosolv Hydrogen peroxide  NaOH0 12 24 36 48 60 72 84 960.00.20.40.60.81.0Glucose (g/g dry biomass)Time (h) Autohydrolysis Organosolv Hydrogen peroxide NaOH XIX SIMPÓSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS X SIMPÓSIO DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE BIOMASSAS  30 de julho-02 de agosto de 2013 Foz de Iguaçu, PR, Brasil       Tabela 1. Parâmetros cinéticos da fermentação de S. cerevisiae CA11 sob a fibra de coco maduro pré-tratada hidrotermicamente catalisada por hidróxido de sódio usando SSF  Rendimento (%) Produção (g/L) Produtividade (g/L/h)Hidrotérmico catalisado com hidróxido de sódio 0.46 89.79 25.83 0.43Pré-tratamento Yx/s Etanol 4. CONCLUSÃO  Os pré-tratamentos realizados nos materiais lignocelulósicos possibilitaram significativas conversões desses materiais em glicose durante a hidrólise enzimática.  A possibilidade de utilizar inúmeras matérias-primas para a produção de etanol por SSF demanda busca por micro-organismos termotolerantes, que, além da possibilidade de flocularem no término do processo fermentativo apresentam resiliência aos compostos inibitórios, tanto oriundos do material lignocelulósico, quanto do etanol produzido. E, em princípio, a S. cerevisiae CA11 apresenta essas características.  5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o financiamento da pesquisa pelas agências de fomento CNPq, CAPES e FUNDECT. 6. REFERÊNCIAS  DOWE, N.; MCMILLAN, J. SSF experimental protocols-lignocellulosic biomass hydrolysis and fermentation. NERL analytical procedure. National Renewable Energy Laboratory: Golden, CO, p. 1-19, 2001. GONÇALVES, F.A.; SANJINEZ-ARGANDOÑA, E.J.; FONSECA, G.G. Utilization of agro-industrial residues and municipal waste of plant origin for cellulosic ethanol production. J. Environ. Protect, v. 2, p. 1303-1309, 2011.  GOUVEIA, E.R.; SANTOS, J.R.A.; SOUTO-MAIOR, A.M.; MARTIN, C. Comparação entre processos em SHF e em SSF de bagaço de cana-de-açúcar para a produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae. Química Nova, v.33, p. 904-908, 2010. LEITE, R.S.R.; BOCCHINI, D.A.; MARTINS, E.S.; SILVA, D.; GOMES, E.; DA SILVA, R. Production of cellulolytic and hemicellulolytic enzymes from Aureobasidium pulluans on solid state fermentation. Appl. Microbiol. Biotech., v. 137-140, p. 1-12, 2007. MANDELS, M.; REESE, E.T. Induction of cellulase in fungi by cellobiose. J. Bacteriology, v. 73, p. 816- 826, 1957. MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal. Chem. v. 31, p. 426-428, 1959. RUIZ, H.A.; SILVA, D.P.; RUZENE, D.S.; LIMA, L.F.; VICENTE, A.A.; TEIXEIRA, J. A. Bioethanol production from hydrothermal pretreated wheat straw by a flocculating Saccharomyces cerevisiae strain – Effect of process conditions. Fuel, v. 95, p. 528-536, 2012. TORIJA, M.J.; ROZÈS, N.; POBLET, M.; GUILLAMÓN, J.M.; MAS, A. Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. Int. J. Food Microbiol., v. 80, p. 47-53, 2003. VERSTREPEN, K.J.; DERDELINCKX, G.; VERACHTERT, H.; DELVAUX, F.R. Yeast flocculation: What brewers should know. Appl. Microbiol. Biotech., v. 61, p. 197-205, 2003. ZHAO, X.Q.; BAI, F.W. Yeast flocculation: new story in fuel ethanol production. Biotechnol. Adv., v. 27, p. 849-856, 2009. 

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