Dissertação de mestrado em Biomedical EngineeringBone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is one of the main representatives
osteoinductive protein of a group of the transforming growth factor-β (TGF-β)
superfamily of multifunctional cytokines. BMP-2 plays a critical role in cartilage and
bone formation during skeletal development and repair. Several clinical studies have
proven the clinical benefit of BMP-2 in the treatment of bone defects, being an effective
alternative to bone grafts. Nowadays, BMP-2 is one of the two bone morphogenetic
proteins approved as biological method to stimulate bone repair in humans. However,
these commercial solutions are expensive, the protein purification is a laborious process
and the obtained yields are low.
A landmark occurred with the cloning of the human BMP-2 gene and its
production by DNA recombinant technology. Production of recombinant human BMP-
2, using prokaryotic systems is the preferred method, being Escherichia coli one of the
most popular systems for protein production. The bacterium E. coli is a well studied
expression system, which provides a fast and economical production of recombinant
proteins. Various studies on the production and purification of BMP-2 protein using E.
coli as expression system have been reported; however BMP-2 is difficult to express in
soluble form and its purification under native conditions remains a challenge.
In this work, the soluble expression of the recombinant BMP-2 protein in E. coli
was studied using the fusion protein technology, with the novel FH8 tag.
The production of soluble recombinant fusion protein was initially achieved
using as backbone the pQE-30FH8 vector, with the study of different culture conditions,
in order to determine the conditions that maximize this soluble expression. Then, in
order to increase soluble expression of FH8BMP-2, the cloning of bmp-2 gene was
performed in two other different vectors: the pETMFH8 and pStaby1.2FH8, using
different E. coli strains. Purification strategy of FH8BMP-2 was performed by the
following chromatography techniques: using the FH8 as purification tag by
hydrophobic interaction (HIC); affinity chromatography with nickel (using the His tag
as purification tag) and ion exchange. The results presented in this work showed that recombinant fusion protein was
successfully soluble expressed in the three vectors used. The pETM system was the one
that showed the highest soluble expression. In relation to purification, the FH8-HIC
technique, when combined with calcium addition to soluble fraction, shows good results
in purification profile of target protein and a high yield of purified protein. Calcium ions
and the own conformation of FH8 can have an important role on the aggregation of
FH8BMP-2 into a dimer.
Overall, the BMP-2 was efficiently expressed in E. coli as a soluble protein and
an optimized purification strategy was developed to obtain this bone morphogenetic
protein under native conditions.
This work may be important for further steps for an in vitro production and
biomedical application of recombinant BMP-2 protein.A proteína morfogenética do osso tipo 2 (BMP-2) é uma das proteínas
osteoindutoras mais representativas da superfamília do fator de transformação do
crescimento β (TGF-β) que agrupa um conjunto de citoquinas multifuncionais. A
proteína BMP-2 desempenha um papel crítico na formação e regeneração do osso e
cartilagem, durante o desenvolvimento do esqueleto. Vários estudos clínicos têm
demonstrado o benefício clínico da BMP-2 no tratamento de defeitos ósseos, sendo uma
alternativa eficaz aos enxertos do osso. Atualmente, a BMP-2 é uma das duas proteínas
morfogenéticas do osso que se encontra aprovada como método biológico para
estimular a reparação óssea em seres humanos. No entanto, estas soluções comerciais
são dispendiosas, a purificação da proteína é um processo laborioso e os rendimentos
obtidos são baixos.
Um marco importante ocorreu com a clonagem do gene humano da proteína
BMP-2 e a sua produção através da tecnologia de DNA recombinante. A produção desta
proteína humana recombinante, utilizando os sistemas procarióticos é o método
preferido, sendo a bactéria Escherichia coli um dos sistemas mais populares de
produção proteica. A bactéria E. coli é um sistema de expressão bem estudado, que
proporciona uma produção rápida e económica de proteínas recombinantes de interesse.
Vários estudos têm reportado a produção e purificação da proteína BMP-2, usando
como sistema de expressão a E. coli; contudo, a proteína BMP-2 é difícil de expressar
na forma solúvel e sua purificação em condições nativas continua a ser um desafio.
Neste trabalho, a expressão solúvel da proteína BMP-2 recombinante em E.coli
foi estudada através da tecnologia de proteínas de fusão, com o novo tag de fusão FH8.
A produção solúvel da proteína de fusão recombinante foi conseguida usando
como vetor inicial o pQE-30FH8, com o estudo das diferentes condições de cultura,
com o objetivo de determinar as condições que maximizam essa expressão solúvel. Em
seguida, com a finalidade de aumentar a expressão solúvel da FH8BMP-2, foi realizada
a clonagem do gene da BMP-2 em dois vetores diferentes: o pETMFH8 e
pStaby1.2FH8, usando diferentes estirpes de E. coli. A estratégia de purificação da proteína FH8BMP-2 envolveu a realização das seguintes técnicas de cromatografia:
interação hidrofóbica (HIC), usando o tag FH8 como tag de purificação; cromatografia
de afinidade com níquel (usando o His tag como tag de purificação) e troca iónica.
Os resultados apresentados neste trabalho mostraram que a proteína de fusão
recombinante foi expressa solúvel com sucesso nos três vetores utilizados. O sistema
pETM foi aquele que apresentou um maior nível de expressão solúvel. Em relação à
purificação, a técnica de FH8-HIC, quando combinada com a adição de cálcio à fração
solúvel, apresenta bons resultados em relação ao perfil de purificação da proteína alvo e
um elevado rendimento de proteína purificada foi obtido. Os iões de cálcio e a própria
conformação do tag FH8 podem ter um importante papel na agregação da FH8BMP-2
na forma dimérica.
Em geral, a BMP-2 foi eficientemente expressa no sistema E. coli como proteína
solúvel e uma estratégia de purificação otimizada foi delineada para obter esta proteína
morfogenética do osso em condições nativas.
Este trabalho pode ser importante para novas etapas de uma produção in vitro e
aplicação biomédica da proteína BMP-2 recombinante
