Tese de doutoramento em Ciências (área de especialização em Biologia)Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a metabolic disorder characterized by
elevated blood glucose levels (hyperglycaemia) as a result of defects in both insulin
secretion and/or action. T2DM represents a major cardiovascular risk since, in addition
to hyperglycaemia, diabetic patients frequently present an abnormal plasma lipid profile
(diabetic dyslipidemia). Since the disease is gaining epidemic proportions, novel or
complementary therapeutic interventions that open new paths for addressing
hyperglycaemia and dyslipidemia may offer promising results to the approaches
presently available. The present thesis aimed to study the effects of two species of the
genus Salvia (S. officinalis and S. fruticosa) in preventing diabetes and its associated
complications. In addition, this work also intended to identify potential antidiabetic and
lipid-lowering natural compounds from these medicinal plants, and to characterize their
mechanisms of action in target organs relevant for diabetes progression (the liver and
the small intestine).
In order to study the antidiabetic potential of Salvia officinalis water extract
(prepared as a tea), a pilot trial was performed in healthy human volunteers, selected
from an age group considered at risk to develop diabetes (chapter 2). This tea
consumption ameliorated the lipid profile and increased the antioxidant defences of the
volunteers, without causing hypoglycaemia and/or hepatotoxicity. These data indicate
that S. officinalis tea may offer compounds with beneficial properties on the prevention
of cardiovascular diseases (CVDs), the major cause of morbidity and mortality in
diabetic patients.
In a subsequent study, using dietary carbohydrate manipulation, the effects of the
aqueous extracts of Salvia fruticosa (SFT) and rosmarinic acid (RA), the major phenolic
compound of S. officinalis and S. fruticosa extracts, in several pathways of the lipid
metabolism were evaluated (chapter 3). While the low carbohydrate (Lc) diet showed to
reduce plasma cholesterol levels, SFT treatment during the four days of the
reintroduction of the normal (referred as the high carbohydrate, [Hc]) diet showed to
increase HDL cholesterol levels. Both SFT and RA treatments showed a potential to
regulate the expression of transcription factors that modulate several lipogenic and cholesterolgenic enzymes. In addition, RA drinking may be useful in modulating the
hepatic fatty acid oxidation and preventing the carbohydrate-induced raise of intestinal
cholesterol uptake.
Chapter 4 is dedicated to the study of the effects of luteolin-7-glucoside (L7G), a
dietary flavonoid also present in S. officinalis extract, on lipid metabolism in healthy
rats. The results indicated that, like RA (chapter 3), L7G stimulated the expression of
genes involved in fatty acid oxidation. In addition, L7G showed to downregulate the
expression of the rate-limiting enzyme of the cholesterol biosynthetic pathway and to
potentially repress the sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1) activity.
Finally, a study was designed to evaluate the effects of glucose and RA in
butyrate (NaBu)-differentiated HT-29 and spontaneously differentiated Caco-2 cells,
frequently deemed good in vitro models of the intestinal epithelium (chapter 5). The
results showed that the cellular growth and differentiation status of both cell lines were
differently affected by glucose. A subcellular fractionation procedure revealed an
increase of the sodium-glucose cotransporter 1 (SGLT1) protein at the apical membrane
(BBM) and a raise on the facilitated glucose transporter 2 (GLUT2) in the remaining
intracellular membrane fraction (including the basolateral membrane, [BLM]) of NaBudifferentiated
HT-29 cells. RA did not affect SGLT1 expression in NaBu-differentiated
HT-29 cells. This evidence disagrees with the previous in vivo observations, where RA
showed to repress BBM SGLT1 expression in response to dietary carbohydrates.
Despite disclosing the same intracellular location in Caco-2 cells, the expression and/or
location of both SGLT1 and GLUT2 were not affected by glucose or insulin. Also in
HT-29 cells, insulin did not modify SGLT1 expression suggesting that, the hormone,
may not contribute to the translocation of the transporter from intracellular storage sites
to the apical membrane.
This work allowed us to conclude that the studied Salvia species and their natural
compounds may be useful in preventing and controlling diabetes and associated
complications, namely dyslipidemia.A diabetes de mellitus tipo 2 (T2DM) é uma doença metabólica caracterizada por
elevados níveis de glucose no sangue (hiperglicemia), como consequência de falhas na
secreção e/ou ação da insulina. A T2DM representa um fator de risco para o
desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCVs) uma vez que, além da
hiperglicemia, os diabéticos apresentam frequentemente níveis anormais de lípidos no
sangue (dislipidemia diabética). Com a doença a atingir proporções epidémicas, surge a
necessidade de encontrar terapias inovadoras ou complementares às metodologias
tradicionalmente usadas no controlo da hiperglicemia e dislipidemia. A presente tese
teve como objetivo estudar os efeitos de duas espécies do género de Salvia (S.
officinalis e S. fruticosa) na prevenção da diabetes e suas complicações. Este trabalho
pretendeu ainda identificar compostos naturais destas plantas medicinais com potencial
antidiabético e de redução lipídica e caracterizar os seus mecanismos de ação no fígado
e no intestino delgado, importantes alvos na progressão da diabetes.
Com o intuito de estudar o potencial antidiabético do extrato aquoso de S.
officinalis (preparado como chá), realizou-se um estudo piloto em voluntárias saudáveis
que, de acordo com a idade, constituíam um grupo de risco para o desenvolvimento da
diabetes (capítulo 2). O consumo deste chá melhorou o perfil lipídico e aumentou as
defesas antioxidantes das voluntárias, sem no entanto provocar hipoglicemia e/ou
hepatotoxicidade. Estas evidências indicam que o chá de S. officinalis pode conter
compostos benéficos para a prevenção das DCVs, a principal causa de morbilidade e
mortalidade em diabéticos.
Num estudo posterior, recorreu-se à manipulação da dieta para avaliar os efeitos
dos extratos aquosos de Salvia fruticosa (SFT) e do ácido rosmarínico (RA), o principal
composto fenólico dos extratos de S. officinalis e S. fruticosa, em alguns processos do
metabolismo lipídico (capítulo 3). A dieta pobre em hidratos de carbono (Lc) diminuiu
os níveis plasmáticos de colesterol enquanto o SFT, administrado aquando da
reintrodução da dieta normal (referida como rica em hidratos de carbono, [Hc]),
aumentou os níveis de HDL no plasma. Ambos os tratamentos (SFT e RA)
demonstraram efeitos na regulação de fatores de transcrição envolvidos na expressão de enzimas que controlam a síntese lipídica. Adicionalmente, o RA demonstrou ser eficaz
na indução de genes envolvidos na oxidação hepática de ácidos gordos e na prevenção
de uma excessiva absorção intestinal de colesterol, como resposta à manipulação da
dieta.
O capítulo 4 é dedicado ao estudo dos efeitos da luteolina-7-glucosideo (L7G),
um flavonoide também presente no extrato de S. officinalis, no metabolismo lipídico em
ratos saudáveis. Os resultados obtidos demonstraram que, tal como o RA (capítulo 3), a
L7G induz a expressão de genes envolvidos na oxidação de ácidos gordos. Além disso,
a L7G diminuiu a expressão da enzima reguladora da síntese endógena de colesterol e
sugeriu uma potencial inibição da atividade do SREBP-1 (um fator de transcrição
regulador da lipogénese).
Por fim, realizou-se um estudo para avaliar os efeitos da glucose e do RA em
células HT-29, diferenciadas com butirato (NaBu) e Caco-2, diferenciadas
espontaneamente em cultura. Estas linhas celulares são frequentemente consideradas
bons modelos in vitro do epitélio intestinal (capítulo 5). Verificou-se que o crescimento
e o estado de diferenciação de ambas as linhas celulares foram distintamente afetados
pela glucose. O isolamento de frações celulares revelou um aumento da expressão
proteica do transportador da glucose SGLT1 na membrana apical (BBM) e um
enriquecimento do transportador da glucose GLUT2 na fração das restantes membranas
intracelulares (incluindo a membrana basolateral, [BLM]) em células HT-29
diferenciadas com NaBu. A expressão do SGLT1 nesta linha celular não foi afetada
pelo RA. Esta observação opõe-se aos resultados previamente obtidos in vivo, que
demonstraram a eficácia do RA para prevenir o aumento dos níveis de SGLT1 na BBM,
em consequência da manipulação dos hidratos de carbono na dieta. Os transportadores
(SGLT1 e GLUT2) demonstraram possuir a mesma localização intracelular em Caco-2
contudo, a expressão e a localização de ambas as proteínas não foram afetadas pela
glucose nem pela insulina. Do mesmo modo, os níveis proteicos e a localização
intracelular do SGLT1 em HT-29 não foram afetados pela insulina podendo isto indicar
que, esta hormona, não intervém no processo de transporte do SGLT1 intracelular para
a membrana apical.
Este trabalho permitiu concluir que as espécies de Salvia e os seus compostos
naturais presentemente estudados, podem ser eficazes na prevenção e no controlo da
diabetes e suas complicações, nomeadamente a dislipidemia