Tese de doutoramento em Engenharia Química e BiológicaEscherichia coli (E. coli) is part of the commensal microflora of the chicken intestinal
tract, being commonly an opportunistic bacteria that causes disease in immunologic
deprived chickens. However, there are extra-intestinal E. coli strains, the avian
pathogenic Escherichia coli (APEC) that are able to cause colibacillosis by itself, due to
its invasive ability. The colibacillosis and colisepticemia are responsible for significant
economic losses in poultry industries worldwide, mainly due to the low feed conversion
rate with consequent weight loss, high cost of treatments during production, poor
carcass quality with consequent rejection at slaughter and high mortalities rates. The
increasing high patterns of antibiotic resistance acquired by these bacteria, as well as the
restriction to the antibiotic usage implemented by the European Union, have encouraged
the search of new solutions to control severe infections ensuring good meat quality and
minimizing environmental impact.
Bacteriophages (phages), virus infecting exclusively bacteria, have been proposed as
valuable alternatives to antibiotics based on their capacity to infect and destroy the
bacteria, releasing in few minutes progeny that will infect the surrounding hosts.
The presented work aimed at developing an efficient, safe and competitive phage based
product to control colibacillosis in poultry. The work encompassed five different stages:
firstly, different bacteriophages active for a wide range of APEC strains were isolated
and characterized; secondly, an in vivo evaluation of the toxicity of the phage
suspensions were performed, thirdly the effect of the route of administration and phage
titre on phage dissemination in the chickens’ organisms was assessed; fourthly the
efficacy of the phages presenting the wider lytic spectrum was evaluated through in vivo
efficiency trials; finally, large animal trials were performed to validate the efficacy of
the phage product.
Phages were isolated from poultry sewage and tested against 148 O-serotyped APEC
strains. The results showed that 70.5% of the tested strains were sensitive to a
combination of three of the five isolated phages. Taxonomically, two of these three
phages, phi F61E and phi F78E look like 16-19, T4-like phages (Myoviridae) and the
other, phi F258E is a T1-like phage and belongs to the Syphoviridae family. All belong
to the Caudovirales order. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) patterns
demonstrate that all phages were genetically different. The in vivo evaluation of the
toxicity of the phage lysate revealed that the phage suspensions did not promote any decrease in feed and water intake, or body weight lost during the in vivo trial and the
post mortem necropsies did not show any macroscopic lesions in the internal organs.
These observations supported that the lysate was not toxic for chickens.
The in vivo assessment of the effect of the route of administration and the dosage in the
dissemination of the phages in the chicken’s organs, revealed that when administered
orally and by spray, all the phages reached the respiratory tract, as well as the
bloodstream. Intramuscular administration enabled the phages to reach all chickens’
internal organs. Results suggested that, besides the intramuscular administration (not
feasible to use in flocks), the oral and spray administration can be considered promising
administration routes to treat respiratory E. coli infections in poultry.
The in vivo evaluation of the efficacy of phi F78E to control severe E. coli infections
revealed that phage performance is dosage dependant and only a high concentration of
109 PFU/ml allowed a decrease in 25% and 43% in chickens’ mortality and morbidity,
respectively. Interestingly, the phage cocktail (of phi F61E, phi F78E and phi F258E)
administered in the water drinking and by spray in a single application, and composed
by 5×107 PFU/ml of each bacteriophage, was able to control the mortality rate in
naturally infected chicken flocks, refractive to antibiotherapy. The mortality felt from
2.2% in average, to under 0.5% in no more than three weeks, with no recidivism.
In conclusion, with this work it was possible to obtain an antimicrobial product,
comprised by a combination of three different lytic phages, which demonstrated to be
safe for chickens and efficient against colibacillosis in the poultry industry.A Escherichia coli (E. coli) é uma bactéria que integra a flora intestinal das aves, e que
frequentemente se comporta como oportunista, causando doença em aves imunodeprimidas.
Contudo, existem estirpes extra-intestinais patogénicas (APEC) que são
capazes, pelas suas capacidades invasivas, de causar infecções (colibacilose) que podem
degenerar em septicemias. Estas infecções são responsáveis por perdas económicas
importantes na indústria avícola, devido a baixas taxas de conversão alimentar com
consequentes perdas de peso das aves, elevados custos de tratamento na produção, baixa
qualidade da carcaça que leva a rejeições no matadouro e elevadas taxas de mortalidade.
O aumento do padrão de resistências a antibióticos adquiridos por estas bactérias, bem
como as restrições que a Comunidade Europeia tem vindo a impor no uso destes antimicrobianos,
vem relançar a importância do desenvolvimento de alternativas
terapêuticas.
Os bacteriófagos (fagos), são vírus que parasitam exclusivamente bactérias e que têm
vindo a surgir como alternativa valiosa à terapia tradicional. A sua capacidade de
infectar e destruir bactérias hospedeiras, libertando nova geração com potencial para
infectar os hospedeiros circundantes são características que corroboram a sua valia.
O presente trabalho visou o desenvolvimento de um produto à base de fagos para o
controlo de colibaciloses na indústria avícola, que se mostrasse eficiente e inócuo e que
fosse competitivo. O trabalho compreendeu cinco fases diferentes: em primeiro lugar,
bacteriófagos distintos que infectavam uma vasta gama de estirpes APEC foram
isolados e caracterizados; seguidamente, foi efectuada a avaliação in vivo da toxicidade
da suspensão de fagos; em terceiro lugar, foi testada a influência da via de
administração e da concentração de fagos na sua disseminação no organismo das aves;
posteriormente a eficiência dos fagos com o espectro de lise mais amplo foi avaliada,
através de experimentação in vivo; finalmente foram realizadas experiências em aviários
experimentais para validar a eficácia do produto à base de fagos.
Os fagos foram isolados de camas de aviários e testados para 148 APEC serotipadas
para o antigénio “O”. Destas, 70.5% revelaram-se sensíveis a pelo menos um de três dos
fagos. Taxonomicamente, todos os fagos se inserem na ordem dos Caudovirales, sendo
que dois deles, o phi F61E e o phi F78E são fagos 16-19, do tipo T4 (Myoviridae) e o
outro, phi F258E é um fago do tipo T1 (Syphoviridae). Padrões de RFLP demonstraram
que todos os fagos são geneticamente diferentes. A avaliação in vivo da toxicidade do lisado de fagos revelou que a suspensão de fagos
não provocou qualquer diminuição na ingestão de alimento e água nem perda de peso, e
a avaliação post mortem das carcaças não revelou lesões macroscópicas nos órgãos.
Estas observações corroboram a inocuidade do produto, para as aves.
As experiências in vivo para analisar o efeito da via de administração e da concentração
da suspensão, na disseminação dos fagos no organismo das aves, indicou que quando
administrados por via oral e por spray, qualquer dos tipos de fago em teste atingiram o
tracto respiratório e a corrente sanguínea. A administração intra-muscular, permitiu que
os fagos testados fossem recuperados em todos os órgãos analisados. Os resultados
sugerem que, para além da administração intramuscular (modo que não é prático para o
maneio em bandos), a administração oral e nasal deverão ser veículos eficientes de
transporte de fagos para o tratamento de infecções respiratórias por E. coli em aves.
A avaliação in vivo da eficiência do phi F78E para o controlo de infecções severas de E.
coli, revelou que o desempenho do fago estava dependente da dose, e que apenas uma
concentração elevada, de 109 PFU/ml, permitiu um decréscimo na mortalidade e
morbilidade das aves, respectivamente de 25% e 43% em média.
Curiosamente, a combinação de fagos (phi F61E, phi F78E e phi F258E), numa
concentração de 5×107 PFU/ml cada um, administrado na água de bebida e por spray
numa única aplicação, foi eficiente no controlo da mortalidade em bandos naturalmente
infectados por APEC, e em que os antibióticos não tinham tido sucesso terapêutico. A
mortalidade desceu, em média, de 2.2% para valores inferiores a 0.5% em não mais de 3
semanas, sem recidivas. Em conclusão, este trabalho possibilitou o desenvolvimento de
um produto constituído por três fagos, que demonstrou ser inócuo e eficiente no
controlo de colibacilose na indústria avícola.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), SFRH/BDE/15508/200
