Apresentação efectuada no "Simpósio de Vitivinicultura do Alentejo, 7, Évora, 2010"A levedura Saccharomyces cerevisiae é caracterizada por uma elevada variabilidade fenotípica, que está associada à ocorrência de estirpes em habitats naturais diversificados. Em trabalhos anteriores, demonstrámos a elevada diversidade de estirpes isoladas a partir de ambientes vitivinícolas na Região dos Vinhos Verdes, bem como a ocorrência de estirpes características para cada terroir. A recolha de estirpes autóctones foi alargada a outras regiões (Alentejo, Açores, Bairrada, Dão, Douro, Estremadura e Ribatejo), incluindo as castas mais representativas (Alvarinho, Aragonês, Arinto, Avesso, Baga, Bical, Castelão, Loureiro, Maria Gomes, Terrantez, Touriga Nacional e Verdelho). Pelo uso de diferentes marcadores moleculares foram identificadas 662 estirpes a partir dos 4470 isolados recolhidos. A colecção de S. cerevisiae de ambientes vitivinícolas é utilizada para a selecção de estirpes mais apropriadas para vinificação e que realçam as propriedades sensoriais características. Adicionalmente, constitui um recurso para a conservação da biodiversidade e partilha de dados genéticos.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Programa Operacional Ciência e Inovação POCI2010 , POCI/AGR/56102/2004), PTDC(AGR-ALI/103392/2008)Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)Direcção Regional para a Ciência e Tecnologia (DRCT

Alemão, F.

Araújo, Isabel M.

Casal, Margarida

Duarte, Filomena

Gomes, Ana Catarina

Lima, Maria Teresa

Machado, Raul

Neves, J. Drumonde

Ramos, P.

Santos, Manuel A. S.

Schuller, Dorit Elisabeth

Silva, Paulo

Sousa, Susana

Vieira, E.

Universidade do Minho: RepositoriUM

A colecção de estirpes autóctones de Saccharomyces cerevisiae das principais regiões vitivinícolas portuguesas

A colecção de estirpes autóctones de  
Saccharomyces cerevisiae das principais Regiões 
Vitivinícolas Portuguesas
(1) Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, Campus de Gualtar, Braga
(2) BIOCANT, Centro de Inovação em Biotecnologia, BIOCANT PARK - Parque Tecnológico de 
Cantanhede, Cantanhede
(3) Instituto Nacional de Recursos Biológicos, IP, Instituto Nacional de Investigação Agrária, 
Dois Portos
(4) CESAM e Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro, Campus Universitário de 
Santiago, Aveiro
(5) Centro de Investigação de Tecnologias Agrárias – Departamento de Ciências Agrárias, 
Universidade dos Açores. 
(6) Vinalia - Soluções de Biotecnologia para a Vitivinicultura, Spin-off da Universidade do Minho, 
Braga
E. Vieira1,6; J. Drumonde-Neves1,5; R. Machado1; P. Silva1; A.C. Gomes2; S. Sousa2; 
P.T. Ramos3; F. Alemão3; M.T. Lima5, I. Araújo6; F.L. Duarte3; M.A. Santos2,4; M. 
Casal1; D. Schuller1
Introdução
Recorrer a leveduras secas activas (LSA) garante fermentações consistentes e 
homogeneidade da qualidade dos vinhos em anos consecutivos.
O uso de espécies/estirpes autóctones é preferível porque:
 estão mais adaptadas ao micro-ecossistema e clima de cada região;
 possuem melhor capacidade de predominar sobre a flora microbiana não
desejável; 
 contribuem de forma favorável para o perfil característico dos vinhos de cada
região.
Das cerca de 200 LSA existentes no mercado apenas três estirpes de 
leveduras foram isoladas em Portugal (Vinho Verde, Dão e Bairrada)
Introdução
A compilação dos trabalhos efectuados levou à constituição de uma colecção de estirpes 
autóctones de S.cerevisiae para trabalhos futuros que visam:
 Conservar a biodiversidade de estirpes indígenas;
 Avaliar o potencial enológico das estirpes de acordo com critérios de selecção    
técnológicos, organolépticos e de segurança alimentar.
Carbamato de etilo, 
aminas biogénicas e 
metanol. 
Compostos secundários e 
compostos aromáticos
Vigor, taxa e temperatura da fermentação
Resistência ao SO2 e ao Cobre
Floculação e produção de espuma
Propriedade Killer
Critérios de Segurança 
Alimentar
Critérios OrganolépticosCritérios Tecnológicos
Estudos biogeográficos realizados em diferentes sub-regiões dos Vinhos Verdes, 
demonstraram uma elevada diversidade genética das estirpes de S. cerevisiae e verificou-se 
a ocorrência de estirpes indígenas características para cada vinha (Schuller et al., 2005;Schuller et al., 2007).
1 2
3
9
8
7
5
11
6
27
29
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23
22
26
25
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18
1715
14 16
13
Locais de Amostragem
Avesso
Arinto
Loureiro
Aragonês
Castelão
Baga
Bical
M. Gomes
Verdelho
Terrantez
Alvarinho
T. Nacional
9 Regiões Vitivinícolas
12 Castas
37 vinhas
Desde 2001 foram recolhidas
623 amostras em
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
-70
-80
-90
-100
1 6 11 16 21 26
Tempo (dias)
P
e
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a
 d
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 p
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s
o
 (
g
/L
)
Fermentação
espontânea
Materiais e Métodos
Isolamento
• 0 g/L
• -2 g/L
• -35 g/ L
• -70 g/ L
Isolamento de leveduras
Identificação 
dos isolados
Métodos Moleculares
Perfis de restrição de 
DNA mitocondrial
(mtDNA RFLP)
Amplificação de 
sequências Interdelta
Análise
preliminar
Análise de 
Microssatélites
Microssatélite Crom. Posição/ORF Repet.
ScAAT 1 XIII 86 901 – 87 129 ATT
ScAAT 2 II YBL084c ATT
ScAAT 3 IV YDR160w ATT
ScAAT 4 VII 431 334 – 431 637 ATT
ScAAT 5 XVI 897 028 - 897 259 TAA
ScAAT 6 IX 105 661 – 105 926 TAA
YPL009 XV YOR156c TAA
ScYOR267C XV YOR267c TGT
C4 XV 110 701-110 935 TAA+TAG
C5 VI 210 250-210 414 GT
AAT1
AAT6
AAT4
AAT5
AAT3 AAT2
Materiais e Métodos
Métodos moleculares para identificação dos isolados
Análise
discriminatória
Resultados
(*)16505588Açores
137 (*)63022126Bairrada
910203438Estremadura
(*)10203453Alentejo
015056Palmela
(*)210712Ribatejo
662
(*)
(*)
516
Saccharomyces 
cerevisiae
Nº amostras
recolhidas
Fermentações 
Espontâneas
Nº de Isolados
Vinhos Verdes 282 115 3450
Douro 12 6 180
Dão 6 6 180
Total 623 285 8520
(*) Análises em curso
Estirpes de S. cerevisiae obtidas nas diferentes regiões
Aragonês
Arinto
Touriga Nacional
Castelão
Trincadeira
Baga
Alvarinho
Loureiro
Dia Dia
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)
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Dia Dia
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g
/l
)
P
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 p
e
so
 (
g
/l
)
S. cerevisiae
Não – Saccharomyces
Nº de estirpes 
22 18 1212
Nº de estirpes 
121 1
Resultados
Cinética de fermentação
T.
  
N
a
c
io
n
a
lAvesso ArintoAlvarinho Loureiro
Vinhos Verdes
Estirpes de S. cerevisiae envolvidas em fermentações espontâneas
2
0
0
1
2
0
0
1
2
0
0
2
2
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2
2
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2
0
0
6
Resultados
2
0
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3
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0
9
Amostras que não iniciaram fermentação
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9
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● Análises em curso
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●
● 3
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5
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10
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23
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310
15
18
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5
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20
16
7
6
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1
1
4
4
Amostras da mesma vinha
Bical T.  NacionalBaga M. Gomes
Bairrada
Estirpes de S. cerevisiae envolvidas em fermentações espontâneas
Aragonês
Amostras que não iniciaram fermentação
Resultados
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2
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7
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2
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2
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3
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Análises em curso●
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Não-Saccharomyces■
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Amostras da mesma vinha
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Alentejo
Alentejo
Alentejo
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2009
Estremadura
Estremadura
Estremadura
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2007
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Estremadura
Palmela
Ribatejo
Ribatejo 2009
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Alentejo
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Alentejo
Alentejo
Douro
Douro
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Estremadura
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Açores - 2009
Estirpes de S. cerevisiae envolvidas em fermentações espontâneas
Resultados
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Amostras que não iniciaram fermentação espontânea Análises em curso●
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Verdelho Terrantez Híbridos Produtores directos
Resultados
A base de dados de estirpes autóctones de S. cerevisiae
http://scwsc.bio.uminho.pt
Permite consultar 
informação sobre:
•Castas
•Regiões Vitivinícolas
•Métodos de identificação
•Estirpes/ Dados genéticos
•Publicações
Resultados
A base de dados de estirpes autóctones de S. cerevisiae
Possibilita pesquisar as 
estirpes isoladas por:
•Nº de isolado 
•Regiões Vitivinícolas
•Vinha 
•Castas
Cada estirpe  tem 
informação detalhada 
sobre a sua origem e 
isolamento e as suas 
combinações alélicas de 
microssatélites.
Conclusões
Esta colecção de estirpes de S. cerevisiae constitui um recurso importante 
tanto para estudos de avaliação e de conservação da biodiversidade, como 
também para a futura selecção de estirpes que poderão ser utilizadas na 
produção de vinhos com aromas diferenciadores.
Abordagens futuras…
AAT1
AAT6
AAT4
AAT5
AAT3
Genética
Analítica
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00
2,25
2,50
2,75
0 6
1
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6
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6
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3
1
2
0
d
C
O
2
 /d
t
(g
/lh
)
Comportamento fermentativo
Perfil fermentativo
horas
Bioinformática
Métodos computacionais
Previsão de características
a partir de dados genéticos
Agradecimentos
Rui Cunha
Anselmo Mendes
Euclides Rodrigues 
José Domingues
João Melícias
Frederico Gomes 
Leonor Novais
Magda Silva Graça
Hugo Alves
Sofia Machado
Barbara Dellinger
A todas as empresas e produtores que nos facultaram amostras
Este trabalho foi financiado pelos programas 
POCI 2010 (FEDER /FCT, 
POCTI/AGR/56102/2004), PTDC (AGR-
ALI/103392/2008) e do Sétimo Programa 
Quadro da Comunidade Europeia (7PQ / 2007-
2013) sob o contrato n º 232454.


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Livro de Actas on-line em http://www.ateva.pt/8-simposio-de-vitivinicultura-do-alentejo/A levedura Saccharomyces cerevisiae é caracterizada por uma elevada variabilidade fenotípica, que está associada à ocorrência de estirpes em habitats naturais diversificados. Em trabalhos anteriores, demonstrámos a elevada diversidade de estirpes isoladas a partir de ambientes vitivinícolas na Região dos Vinhos Verdes, bem como a ocorrência de estirpes características para cada terroir. A recolha de estirpes autóctones foi alargada a outras regiões (Alentejo, Açores, Bairrada, Dão, Douro, Estremadura e Ribatejo), incluindo as castas mais representativas (Alvarinho, Aragonês, Arinto, Avesso, Baga, Bical, Castelão, Loureiro, Maria Gomes, Terrantez, Touriga Nacional e Verdelho). Pelo uso de diferentes marcadores moleculares foram identificadas 662 estirpes a partir dos 4470 isolados recolhidos. A colecção de S. cerevisiae de ambientes vitivinícolas é utilizada para a selecção de estirpes mais apropriadas para vinificação e que realçam as propriedades sensoriais características. Adicionalmente, constitui um recurso para a conservação da biodiversidade e partilha de dados genéticos.Eugénia Vieira e João Drumonde Neves são recipientes de bolsas de doutoramento SFRH/BDE/33672/2009 (FCT) e M3.1.2/F/006/2008 (DRCT), respectivamente. Este estudo foi financiado pelos projectos POCI/AGR/56102/2004 e PTDC/AGRALI/103392/2008 da Fundação para a Ciência e Tecnologia, e recebeu também financiamento do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013) sob o contrato n º 232454. Os autores agradecem a todas as empresas e enólogos que apoiaram este estudo

1  A COLECÇÃO DE ESTIRPES AUTÓCTONES DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE DAS PRINCIPAIS REGIÕES VITIVINÍCOLAS PORTUGUESAS  E. VIEIRA1,6; J. DRUMONDE-NEVES1,5; R. MACHADO1; P. SILVA1; A.C. GOMES2; S. SOUSA2; P.T. RAMOS3; F. ALEMÃO3; M.T. LIMA5, I. ARAÚJO6; F.L. DUARTE3; M.A. SANTOS2,4; M. CASAL1; D. SCHULLER1  (1)  Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, Campus de Gualtar, Braga (2)  BIOCANT, Centro de Inovação em Biotecnologia, BIOCANT PARK - Parque Tecnológico de Cantanhede, Cantanhede (3)  Instituto Nacional de Recursos Biológicos, IP, Instituto Nacional de Investigação Agrária, Dois Portos (4)  CESAM e Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro, Campus Universitário de Santiago, Aveiro (5)  Centro de Investigação de Tecnologias Agrárias – Departamento de Ciências Agrárias, Universidade dos Açores.  (6)  Vinalia - Soluções de Biotecnologia para a Vitivinicultura, Spin-off da Universidade do Minho, Braga  RESUMO A levedura Saccharomyces cerevisiae é caracterizada por uma elevada variabilidade fenotípica, que está associada à ocorrência de estirpes em habitats naturais diversificados. Em trabalhos anteriores, demonstrámos a elevada diversidade de estirpes isoladas a partir de ambientes vitivinícolas na Região dos Vinhos Verdes, bem como a ocorrência de estirpes características para cada terroir. A recolha de estirpes autóctones foi alargada a outras regiões (Alentejo, Açores, Bairrada, Dão, Douro, Estremadura e Ribatejo), incluindo as castas mais representativas (Alvarinho, Aragonês, Arinto, Avesso, Baga, Bical, Castelão, Loureiro, Maria Gomes, Terrantez, Touriga Nacional e Verdelho). Pelo uso de diferentes marcadores moleculares foram identificadas 662 estirpes a partir dos 4470 isolados recolhidos. A colecção de S. cerevisiae de ambientes vitivinícolas é utilizada para a selecção de estirpes mais apropriadas para vinificação e que realçam as propriedades sensoriais características. Adicionalmente, constitui um recurso para a conservação da biodiversidade e partilha de dados genéticos.   Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae; Colecção de leveduras; Leveduras autóctones.   1 - INTRODUÇÃO  As leveduras que conduzem a fermentação alcoólica contribuem de forma decisiva para a estrutura, complexidade e individualidade do perfil aromático de vinhos. Estes microrganismos fazem parte da microflora que se encontra na superfície da uva, do interior da adega e de culturas starter, também designadas por estirpes industriais ou leveduras secas activas (LSA). Actualmente, existem cerca 200 LSAs e a maioria dos produtores de vinhos na Europa recorrem à sua utilização, uma vez que são considerados factor de garantia para uma fermentação rápida e consistente, e mantêm a homogeneidade de vinhos em anos consecutivos. No entanto, estas leveduras foram maioritariamente obtidas a partir de castas e de regiões vitivinícolas desconhecidas, que não possuem qualquer semelhança 2  com as tipicidades das castas Portuguesas. O uso de espécies/estirpes autóctones é sempre preferível devido à sua melhor adaptação ao micro-ecossistema e às condições climáticas de cada região, à capacidade de predominância sobre a flora microbiana não desejável, bem como à manutenção das propriedades sensoriais e do perfil característico dos vinhos de cada região. Apesar da sua longa história e tradição enraizada como país produtor de vinhos, em Portugal foram seleccionadas apenas 3 estirpes comerciais de S. cerevisiae das regiões vitivinícolas do Vinho Verde, Dão e Bairrada.  Estudos de genómica comparativa, recentemente realizados, revelaram os factores genéticos que moldam a capacidade de adaptação de S. cerevisiae a diferentes ambientes e que definem as suas características fenotípicas. A elevada diversidade genómica entre estirpes de S. cerevisiae afecta diferentes níveis genéticos, desde a frequência e localização de polimorfismos nucleotídicos até a variabilidade no número de cópias de genes (CARRETO et al., 2008; LITI et al., 2009; SCHACHERER et al, 2009). O grupo de estirpes europeias de vinificação distingue-se das populações de outros continentes pela capacidade de fermentar rapidamente os açúcares do mosto e pela elevada variabilidade fenotípica (LITI et al., 2009). A sequenciação completa do genoma de numerosas estirpes de S. cerevisiae de vinificação vai possibilitar a determinação dos factores genéticos envolvidos nas vias metabólicas dos principais compostos aromáticos.  No âmbito de estudos anteriores (SCHULLER et al., 2005; VALERO et al., 2005; VALERO et al, 2007; SCHULLER et al., 2007), foi demonstrada a elevada diversidade genética das estirpes de S. cerevisiae e a ocorrência de isolados característicos para diferentes sub-regiões da Região dos Vinhos Verdes. A colecção de estirpes autóctones foi alargada a outras regiões (Alentejo, Açores, Bairrada, Dão, Douro, Estremadura, Palmela e Ribatejo), incluindo as castas mais representativas (Alvarinho, Aragonês, Arinto, Avesso, Baga, Bical, Castelão, Loureiro, Maria Gomes, Terrantez, Touriga Nacional e Verdelho). Esta colecção de estirpes de S. cerevisiae constitui um recurso importante tanto para estudos de avaliação e de conservação da biodiversidade, como também para a produção vinhos com aromas diferenciadores.     3  2 - OBTENÇÃO DOS ISOLADOS DE S. CEREVISIAE A recolha das amostras de uvas foi efectuada ao longo de vários anos em 37 vinhas de 9 regiões vitivinícolas, conforme indicado na Figura 1. Foram colhidos 2kg de uvas em cada um de 6 pontos de amostragem por vinha. Realizaram-se fermentações espontâneas a partir do mosto, a 22ºC. Na fase final da fermentação obtiveram-se 30 colónias que foram armazenadas (glicerol, 30%, v/v; -80ºC) para posterior extracção de DNA e identificação molecular pelos métodos abaixo mencionados.  Conforme resumido na Tabela 1, colheram-se 623 amostras das principais castas Portuguesas (Alvarinho, Aragonês, Arinto, Avesso, Baga, Bical, Castelão, Loureiro, Maria Gomes, Terrantez, Touriga Nacional e Verdelho), sendo algumas amostragens realizadas nos mesmos locais em anos consecutivos. De todas as amostras colhidas até 2009, 46% (284) realizaram fermentações espontâneas completas, o que permitiu obter 8520 isolados. Até à data foram analisados 4470 isolados, obtendo-se 662 estirpes diferentes de S. cerevisiae. A identificação de mais 4050 isolados está actualmente em curso.                        Figura 1 - Locais de amostragem nas diferentes Regiões Vitivinícolas em Portugal continental e ilhas.   4   Tabela 1 -  Resumo das estirpes de S. cerevisiae obtidas a partir das amostras recolhidas nas diferentes regiões, para cada casta e ao longo dos anos 2001 a 2009.    Região Casta Localização (consoante Figura 1)  Nº de amostras recolhidas Nº de fermentações espontâneas Nº de isolados colhidos Nº de estirpes de S. cerevisiae  Alvarinho 1, 2, 4 84 42 1260 202 Avesso 9, 4, 8 78 30 900 145  Arinto 4, 7 24 7 210 31  Loureiro 11, 10, 4, 5 72 28 840 120 Touriga Nacional 4, 10 24 8 240 18 Vinhos Verdes Total    282 115 3450 516   Baga 12, 15, 18 30 10 300 60   Bical 12, 14 24 1 30 1   Maria Gomes 12, 17 24 1 30 19   Aragonez 12, 13 24 3 90 19   Touriga Nacional 12, 16 24 7 210 38 Bairrada Total   126 22 630 137   Aragonez 19, 20 10 7 210 3   Arinto 19, 20 11 10 300 1   Castelão 19, 20 6 6 180 1   Trincadeira 19 1 1 30 0   Touriga Nacional 19, 20 10 10 300 4 Estremadura Total   38 34 1020 9   Aragonez 21, 22, 23 24 14 420 0   Trincadeira 21 6 4 120 0   Touriga Nacional 21 12 6 180 0 Alentejo Total   53 34 1020 0 Castelão 24 6 5 150 0 Palmela Total   6 5 150 0 Castelão 25 6 3 90  Castelão 26 6 4 120   Ribatejo Total   12 7 210 Análise em curso   Aragonês 27 6 4 120    Touriga Nacional 28 6 2 60  Douro Total   12 6 180 Análise em curso Touriga Nacional 29 6 6 180  Dão Total   6 6 180 Análise em curso Arinto 3 2 60  Verdelho 2 2 60  Híbridos  30 2 0 0  Açores  (Biscoitos) Total   7 4 120 Análise em curso Arinto 2 2 60  Verdelho 4 4 120  Híbridos  31 8 6 180  Açores  (Graciosa) Total   14 12 360 Análise em curso Arinto 7 6 180  Verdelho 4 4 120  Terrantez 1 0 0  Hibridos  32 15 10 300  Açores  (Pico) Total   27 20 600 Análise em curso Arinto 1 0 0  Terrantez 3 3 90  Verdelho 3 2 60  Híbridos  33-37 33 14 420   Açores  (zonas  não demarcadas) Total   40 19 570 Análise em curso               TOTAL   623 284 8520 662     5  Dia -70-60-50-40-30-20-1000 5 10 15 20 25 30 35-70-60-50-40-30-20-1000 5 10 15 20 25 30 35Perda de peso (g/L)-70-60-50-40-30-20-1000 5 10 15 20 25 30 35Perda de peso (g/L)-70-60-50-40-30-20-1000 5 10 15 20 25 30 35 3 - FERMENTAÇÕES ESPONTÂNEAS   O progresso das fermentações espontâneas foi monitorizado pela determinação da diminuição da massa do mosto (libertação de CO2). As fermentações realizadas com castas recolhidas na Região dos Vinhos Verdes foram realizadas por S. cerevisiae. As fermentações de mostos da Bairrada foram realizadas, em alguns casos, por espécies não-Saccharomyces (por exemplo Candida zemplinina). Esta tendência aumentou para as regiões da Estremadura, Palmela, e Alentejo (sub-região Évora), onde a maioria das fermentações foram realizadas, por exemplo, pelas espécies C. zemplinina, Hanseniaspora uvarum e Issatchenkia orientalis. Apenas em 17% das amostras recolhidas nestas regiões foram encontradas estirpes de S. cerevisiae. Exemplos de perfis fermentativos estão representados na figura 2. As fermentações realizadas por estirpes de S. cerevisiae demoraram maioritariamente 10 a 15 dias. A velocidade da fermentação não foi dependente do número de estirpes intervenientes, que variava entre 1 a 22 (Figura 2 A e B). As fermentações realizadas por espécies não-Saccharomyces decorreram de forma semelhante (Figura 2 D) ou muito mais lentamente (Figura 2 C).                                                                                                                                                                                                                                                                  Figura 2 – Exemplos de perfis de fermentações espontâneas realizadas por estirpes de S. cerevisiae (A: 1-2 estirpes; B: 12-22 estirpes por fermentação) ou por espécies Não-Saccharomyces (C: fermentações lentas; D: fermentações rápidas), em mostos de diferentes castas. A B C D Alvarinho Loureiro Baga Aragonês Arinto Castelão Trincadeira Preta Touriga Nacional Saccharomyces cerevisiae Não - Saccharomyces 6   4 - MÉTODOS MOLECULARES PARA A IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS  Diferentes métodos podem ser utilizados para a distinção de estirpes de S. cerevisiae (análise de microssatélites, sequências interdelta, perfis de restrição de DNA mitocondrial, electroforese em campo pulsado). A tipagem molecular de 23 estirpes comerciais mostrou a equivalência destes métodos (SCHULLER et al., 2004). As sequências delta (300 bp) flanqueiam os retrotransposões TY1 e TY2 ou encontram-se dispersas no genoma de S. cerevisiae. São marcadores muito polimorficos (Figura 3 A), uma vez que o seu número e localização apresentam variabilidade intra-específica (LEGRAS e KARST, 2003; SCHULLER et al., 2004). A análise dos perfis de restrição de DNA mitocondrial (Figura 3 B) baseia-se no diferente teor de GC no genoma nuclear e mitocondrial (40% e 20%, respectivamente). Locais de restrição, por exemplo da enzima HinfI, que são ricas em GC, encontram-se mais frequentemente no genoma nuclear. Contrariamente, o DNA mitocondrial é digerido em fragmentos maiores e que podem ser visualizados por electroforese. Microssatélites são sequências repetitivas de DNA de 2 a 5 nucleótidos. A amplificação de diferentes locis polimorficos e a sua detecção por electroforese capilar (Figura 3 C) é actualmente o método mais discriminatório para a distinção de estirpes de S. cerevisiae (PEREZ et al., 2001; LEGRAS et al., 2005).   Figura 3 – Exemplos de perfis de sequências interdelta (A); DNA mitocondrial (B) e electroferograma de microssatélites (C) de leveduras vinárias.  Todos os isolados foram caracterizados pela análise de sequências interdelta ou perfis de restrição de DNA mitocondrial. Uma estirpe representativa de cada conjunto de isolados que partilhavam o mesmo perfil, foi ainda analisada quanto à sua combinação alélica de 11 microssatélites polimórficos.   A B C 7   4 - A BASE DE DADOS DE ESTIRPES VÍNICAS DE S. CEREVISIAE (SACCHAROMYCES CEREVISIAE WINE STRAIN COLLECTION)  A compilação de todos os dados levou à constituição de uma colecção de estirpes autóctones de S. cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae wine strain collection) que integram uma base de dados alojada no site (Figura 4), que permite fazer pesquisar as estirpes isoladas consoante a região, casta, ano de isolamento e características genéticas (alelos de microssatélites). Adicionalmente, permite consultar mais informação sobre as castas, regiões, detalhes experimentais e métodos moleculares utilizados. Prevê-se que o número de estirpes aumente ainda com a conclusão das tipagens moleculares de isolados obtidos nas regiões das ilhas dos Açores, Dão, Douro e Ribatejo. Estes materiais podem ser utilizados para a avaliação do seu potencial enológico. Adicionalmente, constituem um recurso importante para estudos de genómica evolutiva e ambiental.               Figura 4 – Homepage da base de dados de estirpes vínicas de S. cerevisiae.   http://scwsc.bio.uminho.pt 8   5 – CONCLUSÕES  A colecção de estirpes de S. cerevisiae é um contributo para a conservação da biodiversidade de leveduras que ocorrem nas principais regiões vitivinícolas Portuguesas. Os trabalhos realizados pretendem contribuir também para a selecção de estirpes mais apropriadas para a vinificação e a manutenção da tipicidade dos vinhos de um determinado local. No futuro próximo, a integração de dados genómicos, proteómicos e metabolómicos de múltiplas estirpes de vinificação vai permitir modelar as interacções entre a casta, a levedura fermentativa e as condições de vinificação no sentido de obter vinhos com o maior potencial aromático possível.  AGRADECIMENTOS Eugénia Vieira e João Drumonde Neves são recipientes de bolsas de doutoramento SFRH/BDE/33672/2009 (FCT) e M3.1.2/F/006/2008 (DRCT), respectivamente. Este estudo foi financiado pelos projectos POCI/AGR/56102/2004 e PTDC/AGR-ALI/103392/2008 da Fundação para a Ciência e Tecnologia, e recebeu também financiamento do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013) sob o contrato n º 232454. Os autores agradecem a todas as empresas e enólogos que apoiaram este estudo.     REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS  Carreto, L., et al. BMC Genomics, 2008, 9:524. Legras, J.L., Karst, F. FEMS Microbiol Lett, 2003, 221: 249-255. Legras, J. L., et al., Int J Food Microbiol, 2005, 102: 73-83 Liti, G., et al. Nature, 2009, 458(7236):337-341. Perez, M.A., et al., Lett Appl Microbiol, 2001, 33: 461-466  Richard, G.F., et al. Res Microbiol,  1999, 150:589-602. Schacherer, J., et al. Nature, 2009, 458(7236):342-345. Schuller, D., et al. FEMS Microbiol Letters, 2004, 231:19-26 Schuller, D., et al. FEMS Microbiology Ecology, 2005, 51: 167-177.  Schuller, D., M. Casal, Antonie Van Leeuwenhoek, 2007, 91(2): 137-150 Valero, E., et al., FEMS Yeast Research, 2005, 5: p. 959-969 Valero, E., et al., FEMS Yeast Research, 2007, 7(2):  317-329  

A colecção de estirpes autóctones de Saccharomyces cerevisiae das principais regiões vitivinícolas Portuguesas

A colecção de estirpes autóctones de  Saccharomyces cerevisiae das principais Regiões Vitivinícolas Portuguesas(1) Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, Campus de Gualtar, Braga(2) BIOCANT, Centro de Inovação em Biotecnologia, BIOCANT PARK - Parque Tecnológico de Cantanhede, Cantanhede(3) Instituto Nacional de Recursos Biológicos, IP, Instituto Nacional de Investigação Agrária, Dois Portos(4) CESAM e Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro, Campus Universitário de Santiago, Aveiro(5) Centro de Investigação de Tecnologias Agrárias – Departamento de Ciências Agrárias, Universidade dos Açores. (6) Vinalia - Soluções de Biotecnologia para a Vitivinicultura, Spin-off da Universidade do Minho, BragaE. Vieira1,6; J. Drumonde-Neves1,5; R. Machado1; P. Silva1; A.C. Gomes2; S. Sousa2; P.T. Ramos3; F. Alemão3; M.T. Lima5, I. Araújo6; F.L. Duarte3; M.A. Santos2,4; M. Casal1; D. Schuller1IntroduçãoRecorrer a leveduras secas activas (LSA) garante fermentações consistentes e homogeneidade da qualidade dos vinhos em anos consecutivos.O uso de espécies/estirpes autóctones é preferível porque: estão mais adaptadas ao micro-ecossistema e clima de cada região; possuem melhor capacidade de predominar sobre a flora microbiana nãodesejável;  contribuem de forma favorável para o perfil característico dos vinhos de cadaregião.Das cerca de 200 LSA existentes no mercado apenas três estirpes de leveduras foram isoladas em Portugal (Vinho Verde, Dão e Bairrada)IntroduçãoA compilação dos trabalhos efectuados levou à constituição de uma colecção de estirpes autóctones de S.cerevisiae para trabalhos futuros que visam: Conservar a biodiversidade de estirpes indígenas; Avaliar o potencial enológico das estirpes de acordo com critérios de selecção    técnológicos, organolépticos e de segurança alimentar.Carbamato de etilo, aminas biogénicas e metanol. Compostos secundários e compostos aromáticosVigor, taxa e temperatura da fermentaçãoResistência ao SO2 e ao CobreFloculação e produção de espumaPropriedade KillerCritérios de Segurança AlimentarCritérios OrganolépticosCritérios TecnológicosEstudos biogeográficos realizados em diferentes sub-regiões dos Vinhos Verdes, demonstraram uma elevada diversidade genética das estirpes de S. cerevisiae e verificou-se a ocorrência de estirpes indígenas características para cada vinha (Schuller et al., 2005;Schuller et al., 2007).1 239875116272928232226252418171514 1613Locais de AmostragemAvessoArintoLoureiroAragonêsCastelãoBagaBicalM. GomesVerdelhoTerrantezAlvarinhoT. Nacional9 Regiões Vitivinícolas12 Castas37 vinhasDesde 2001 foram recolhidas623 amostras em0-10-20-30-40-50-60-70-80-90-1001 6 11 16 21 26Tempo (dias)Perda de peso (g/L)FermentaçãoespontâneaMateriais e MétodosIsolamento• 0 g/L• -2 g/L• -35 g/ L• -70 g/ LIsolamento de levedurasIdentificação dos isoladosMétodos MolecularesPerfis de restrição de DNA mitocondrial(mtDNA RFLP)Amplificação de sequências InterdeltaAnálisepreliminarAnálise de MicrossatélitesMicrossatélite Crom. Posição/ORF Repet.ScAAT 1 XIII 86 901 – 87 129 ATTScAAT 2 II YBL084c ATTScAAT 3 IV YDR160w ATTScAAT 4 VII 431 334 – 431 637 ATTScAAT 5 XVI 897 028 - 897 259 TAAScAAT 6 IX 105 661 – 105 926 TAAYPL009 XV YOR156c TAAScYOR267C XV YOR267c TGTC4 XV 110 701-110 935 TAA+TAGC5 VI 210 250-210 414 GTAAT1AAT6AAT4AAT5AAT3 AAT2Materiais e MétodosMétodos moleculares para identificação dos isoladosAnálisediscriminatóriaResultados(*)16505588Açores137 (*)63022126Bairrada910203438Estremadura(*)10203453Alentejo015056Palmela(*)210712Ribatejo662(*)(*)516Saccharomyces cerevisiaeNº amostrasrecolhidasFermentações EspontâneasNº de IsoladosVinhos Verdes 282 115 3450Douro 12 6 180Dão 6 6 180Total 623 285 8520(*) Análises em cursoEstirpes de S. cerevisiae obtidas nas diferentes regiõesAragonêsArintoTouriga NacionalCastelãoTrincadeiraBagaAlvarinhoLoureiroDia DiaPerda de peso (g/l)Perda de Peso (g/l)Dia DiaPerda de peso (g/l)Perda de peso (g/l)S. cerevisiaeNão – SaccharomycesNº de estirpes 22 18 1212Nº de estirpes 121 1ResultadosCinética de fermentaçãoT.  NacionalAvesso ArintoAlvarinho LoureiroVinhos VerdesEstirpes de S. cerevisiae envolvidas em fermentações espontâneas200120012002200220032003200620062007200720062006Resultados20062006200720072001200120022002200320032006200620072007200620062007200720092009Amostras que não iniciaram fermentação200620062007200720012001200220022003200320062006200720072006200620092009200620062007200720062006200720072007200720062006200720072006200620072007200920092006200620072007411120072007200620062007200752●●●●●●● Análises em curso214462113101219217295812812 3 214271●●●● 332134851210223381921811542044282262211621111231015181121954201676221612111144Amostras da mesma vinhaBical T.  NacionalBaga M. GomesBairradaEstirpes de S. cerevisiae envolvidas em fermentações espontâneasAragonêsAmostras que não iniciaram fermentaçãoResultados2006200620072007200620062007200720092009200620062007200720062006200720072006200620072007200620062007200720062006200720072006200620072007200620062007200720062006200720071121 244 28121328263●●●●Análises em curso●1 1121■■■Não-Saccharomyces■2■11321 2■6■6222441115552Amostras da mesma vinhaT.  NacionalEstirpes deEstirpes deS. S. cerevisiaecerevisiaeenvolvidas em fermentaenvolvidas em fermentaç ções espontâneasões espontâneasResultadosD ã o2 0 0 92 0 0 6Arinto2 0 0 72 0 0 6E s t r e m a d u r aE s t r e m a d u r aA l e n t e j oA l e n t e j oA l e n t e j oA l e n t e j o2 0 0 72 0 0 92 0 0 9E s t r e m a d u r aE s t r e m a d u r aE s t r e m a d u r a2 0 0 62 0 0 72 0 0 6E s t r e m a d u r aP a l m e l aR i b a t e j oR i b a t e j o2 0 0 92 0 0 62 0 0 92 0 0 6A l e n t e j oE s t r e m a d u r a2 0 0 62 0 0 6A l e n t e j oA l e n t e j oD o u r oD o u r oE s t r e m a d u r aE s t r e m a d u r a2 0 0 62 0 0 72 0 0 92 0 0 92 0 0 62 0 0 7●● ●●●● ●●●●●● ●●●●2●●● ●●●● ●●●● ●● ●●● ●● ●Amostras que não iniciaram fermentação espontâneaAnálises em curso●●● ●● ●●●●●● ●Não-Saccharomyces■■■■■ ■■ ■■ ■■ ■■■■ ■■ ■■■ ■■ ■■■ ■■ ■■■■21 ■3 ■AragonêsCastelãoTrincadeiraAçores - 2009Estirpes de S. cerevisiae envolvidas em fermentações espontâneasResultadosGraciosaArintoPicoS. JorgeTerceiraGraciosaPicoS. JorgeTerceiraPicoS. JorgeTerceiraPicoFaialFloresGraciosaS. JorgeS. MiguelS. MariaTerceiraAmostras que não iniciaram fermentação espontânea Análises em curso●●●●●●●● ●●●●●●●●●●●●●● ●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●● ● ●● ●●●Verdelho Terrantez Híbridos Produtores directosResultadosA base de dados de estirpes autóctones de S. cerevisiaehttp://scwsc.bio.uminho.ptPermite consultar informação sobre:•Castas•Regiões Vitivinícolas•Métodos de identificação•Estirpes/ Dados genéticos•PublicaçõesResultadosA base de dados de estirpes autóctones de S. cerevisiaePossibilita pesquisar as estirpes isoladas por:•Nº de isolado •Regiões Vitivinícolas•Vinha •CastasCada estirpe  tem informação detalhada sobre a sua origem e isolamento e as suas combinações alélicas de microssatélites.ConclusõesEsta colecção de estirpes de S. cerevisiae constitui um recurso importante tanto para estudos de avaliação e de conservação da biodiversidade, como também para a futura selecção de estirpes que poderão ser utilizadas na produção de vinhos com aromas diferenciadores.Abordagens futuras…AAT1AAT6AAT4AAT5AAT3GenéticaAnalítica0,000,250,500,751,001,251,501,752,002,252,502,750 613202633404653606673808693100106113120dCO2 /dt(g/lh)Comportamento fermentativoPerfil fermentativohorasBioinformáticaMétodos computacionaisPrevisão de característicasa partir de dados genéticosAgradecimentosRui CunhaAnselmo MendesEuclides Rodrigues José DominguesJoão MelíciasFrederico Gomes Leonor NovaisMagda Silva GraçaHugo AlvesSofia MachadoBarbara DellingerA todas as empresas e produtores que nos facultaram amostrasEste trabalho foi financiado pelos programas POCI 2010 (FEDER /FCT, POCTI/AGR/56102/2004), PTDC (AGR-ALI/103392/2008) e do Sétimo Programa Quadro da Comunidade Europeia (7PQ / 2007-2013) sob o contrato n º 232454.

http://repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/12029/1/Simp%c3%b3sio_Alentejo_Maio.pdf

A colecção de estirpes autóctones de Saccharomyces cerevisiae das principais regiões vitivinícolas portuguesas

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