Tese de doutoramento em Ciência e Tecnologia de Materiais - Área de Biomateriais.Tissue engineering is a new concept emerged as an alternative approach to
tissue and organ reconstruction. It differs from organ transplantation by
regenerating patient’s own tissue and organs avoiding the biocompatibility and
low biofunctionality problems as well as severe immune rejection; which are the
main problems of organ transplantation. Tissue engineering methods generally
require the use of three main components: a porous scaffold that serves as a
matrix, cells and growth factors. The architecture of the tissue engineered
scaffold is an important factor to take into consideration that can modulate
biological response and the clinical success of the scaffold.
Fiber-based scaffolds can provide large surface area and highly
interconnective porous structure for cell attachment and ingrowth as well as
variety of geometric possibilities that can be regulated depending on the
application.
In the works presented in this thesis, we developed different fiber based
structures based on two natural origin polymers, chitosan and starch, for use in
tissue engineering.
In Chapter III, chitosan fibers and fiber mesh scaffolds were produced by
means of wet spinning technique. The tensile strength of produced fibers was
around 205 MPa and Ca-P layer formation could be observed on their surfaces
after 14 days of immersion in simulated body fluid (SBF). In Chapter IV, these
fibers were then used in further studies for the reinforcement of the structure of a
composite material which was consisting of microporous coralline origin
hydroxyapatite microgranules, chitosan membranes and chitosan fibers. This
composite architecture showed 88% (w/w) swelling in one hour and preserved its
complex structure upon long-term incubation. Chitosan fiber meshes were
obtained by moulding a predetermined amount of wet-spun fibers. After 7 days of
culture, it was found that they were able to support osteoblast-like cell
attachment and proliferation. A bone-like apatite layer was obtained on these scaffolds by means of using a simple biomimetic coating process. The apatite
formation was determined by different techniques, including SEM, FTIR-ATR,
EDS, XRD. The influence of biomimetic coating on osteoblast cell behaviour was
also examined by culturing SaOs-2 cells onto scaffolds. The cell population and
ALP enzyme activity were found to be higher in the biomimetic coated scaffolds
than those in uncoated scaffolds. Furthermore, cell presented more spread and
flat morphology when they were seeded on biomimetic coated scaffolds.
Regarding starch-based fiber structures, wet spinning was used in
Chapter VI as an alternative method to melt spinning for production of
starch/polycaprolactone fiber mesh scaffolds. This method seemed to be a very
reproducible way of obtaining the fiber mesh scaffolds, typically with 77%
porosity and mean pore size 250µm. The specific surface of the scaffolds was
measured around 29 mm2/mm3, which was very similar to natural bone. The
surfaces of the scaffolds were then treated with plasma under Ar atmosphere.
Although both treated and untreated scaffolds exhibited ability for osteoblast-like
cell attachment and proliferation, DNA content and ALP enzyme activity were
higher in plasma treated scaffolds.
Finally, and as a new approach to mimic the natural extracellular matrix
(ECM), nano- and micro-fiber combined scaffolds from starch/polycaprolactone
blend were designed by means of two step methodology. Electrospinning was
used to obtain nanofibers on melt-spun micro-fiber meshes. With regard to the
cell culture studies with osteoblast-like cells and rat bone marrow stromal cells,
these new architectures showed excellent cell support ability and very promising
properties to make them a proper tissue engineering scaffold.
In summary, results from these works showed that the designed fiberbased
structures from natural origin polymers could successfully serve as a
scaffold for tissue engineering.Engenharia de tecidos é um conceito novo que emergiu como uma abordagem
alternativa para a reconstrução de tecidos e órgãos. Difere da transplantação de
órgãos na medida em que gera os tecidos e órgãos do próprio doente
melhorando desta forma a biocompatibilidade e funcionalidade, assim como
reduzindo o risco de rejeição pelo sistema imunitário, que são os principais
problemas associados à transplantação de órgãos. Geralmente os métodos de
engenharia de tecidos requerem o uso de três componentes principais: um
suporte poroso que serve de matriz, células e factores de crescimento. A
arquitectura do suporte é um aspecto importante a ter em consideração que
pode modular a resposta biológica e o sucesso clínico do mesmo a longo prazo.
Suportes à base de fibras podem dar origem a uma grande área superficial e a
uma estrutura porosa interconectada para a adesão migração celulares, assim
como uma variedade de possibilidades geométricas que podem ser adaptadas
dependendo da aplicação.
No trabalho apresentado nesta tese foram desenvolvidas, para uso em
engenharia de tecidos, diferentes estruturas à base de fibras produzidas a partir
de dois polímeros de origem natural, sendo estes o quitosano e o amido. Fibras
de quitosano e suportes à base de fibras foram produzidos pela técnica de “wet
spinning”. A resistência à tracção das fibras produzidas foi em média 204.9 MPa
e a formação da camada Ca-P foi observada nas suas superfícies após 14 dias
de imersão em “simulated body fluid” (SBF). Estas fibras foram usadas em
estudos posteriores para o reforço da estrutura do material compósito, que
consiste em microgrânulos de hidroxiapatite de origem coralina microporosa,
membranas e fibras de quitosano. Esta arquitectura compósita apresentou 88%
(p/p) de inchamento ao fim de uma hora e manteve a sua estrutura complexa em
incubações prolongadas. Suportes à base de fibras de quitosano foram obtidos
moldando uma quantidade pré-determinada de fibras produzidas por “wetspinning”.
Após 7 dias de cultura, verificou-se que eram capazes de suportar a adesão e proliferação de osteoblastos. Uma camada de apatite idêntica ao osso
foi obtida nestes suportes através de um processo simples de revestimento
biomimético. A formação de apatite foi determinada por diferentes técnicas, tais
como: SEM, FTIR-ATR, EDS e XRD. A influência do revestimento biomimético
foi também examinada na actividade celular dos osteoblastos, cultivando células
SaOs-2 nos suportes. Observou-se que a população celular e a actividade da
enzima ALP é maior nos suportes com revestimento biomimético do que nos
suportes sem revestimento. Além disso, células semeadas nos suportes com
revestimento biomimético apresentam-se mais espalhadas e com uma
morfologia plana.
Relativamente às estruturas de fibras à base de amido, a técnica de “wet
spinning” é utilizada como uma alternativa à técnica de “melt spinning” para
produção de suportes à base de fibras de amido/policaprolactona. Este método
permite obter de uma forma reprodutível suportes à base de fibras com 77% de
porosidade e tamanho médio de poro de 250 µm. A superfície específica dos
suportes é de aproximadamente 29 mm2/mm3, que é em muito semelhante ao
osso natural. As superfícies dos suportes foram então tratadas com plasma em
atmosfera árgon. Embora ambos os suportes tratados e não tratados por plasma
tenham exibido capacidade para adesão e proliferação dos osteoblastos, o
conteúdo de DNA e a actividade da enzima ALP foram maiores em suportes
tratados.
Numa nova abordagem para mimetizar a matriz extracelular natural (ECM),
foram concebidos, por uma metodologia em duas etapas, suportes combinados
de nano- e micro-fibras a partir de uma mistura de amido/policaprolactona. A
técnica de “electrospinning” é utilizada para produzir nano-fibras no topo de
malhas de micro-fibras sendo estas obtidas por “melt-spun”. No que diz respeito
a estudos de culturas celulares com osteoblastos e células da medula óssea de
rato, estas novas arquitecturas mostraram uma excelente capacidade de suporte
celular como uma estrutura de engenharia de tecidos.
Em resumo, os resultados destes trabalhos demonstraram que as estruturas à
base de fibras, concebidas a partir de polímeros naturais, podem servir com
êxito como suporte para engenharia de tecidos