Protocolos das aulas práticas de Biologia Molecular - Expressão Génica, Mestrado em Genética Molecular, ano lectivo de 2004/2005

Oliveira, Rui Pedro Soares de

Universidade do Minho: RepositoriUM

 Departamento de Biologia da Universidade do Minho Mestrado em Genética Molecular Ano lectivo de 2004/2005, edição de 2004-2006      Estudo da regulação do gene STL1 codificando o sistema de simporte H+/glicerol em Saccharomyces cerevisiae        Protocolos         Rui Oliveira Estudo da regulação do gene STL1 codificando o sistema de simporte H+/glicerol em Saccharomyces cerevisiae  2 Amplificação da cassete de interrupção (ZZ-KanMX) por PCR Protocolo 1. Em microtubos de 200µl, preparar a seguinte mistura de reacção de PCR para a cassete de interrupção e um controlo negativo com omissão do DNA molde (manter sempre a mistura reaccional em gelo): Componente Quantidade (µl) Tampão de reacção 5 dNTP’s 1 Primer 1 1 Primer 2 1 MgCl2 (25mM) 3 Taq DNA Polymerase (Fermentas) 0,5 DNA molde 100ng-1µg H2O ultra-pura q.b.p. 50µl 2. Colocar os tubos no aparelho de PCR e proceder à amplificação com o seguinte programa: Temperatura Tempo Nº de cic los 94ºC 10min  52ºC 3min 1 72ºC 3min     94ºC 30seg  52ºC 3min 34 72ºC 3min     94ºC 30seg  52ºC 3min 1 72ºC 10min  3. Analisar 5µl do produto das reacções por electroforese em gel de agarose 0,8% 4. Se for visível uma única banda correspondendo à massa molecular esperada, proceder à purificação do amplicon com as "MicroSpin S-300 HR Columns" (Amersham Biosciences); anexo 1. Extracção de plasmídeo (pUG35-STL1) de Escherichia coli Seguir o protocolo do kit “GenElute™ Plasmid Miniprep Kit" (Sigma); anexo 2. Transformação de Saccharomyces cerevisiae Protocolo 1. Inocular 5ml de meio YPD com uma só colónia da estirpe de levedura a ser transformada (FVVY24 MATa leu2-3, 112ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 ade2-1 can1-100 stl1::kanMX). Incubar durante a noite a 30°C, 160r.p.m. 2. Inocular 300ml de YPD em balão Erlenmeyer de 1000ml com a cultura de 5ml. Incubar a 30°C, 160r.p.m. até DO600 entre 0,3 e 0,5 (~1x107células/ml) 3. Colher as células por centrifugação 5min a 4000g. Ressuspender em 10ml de água ultra-pura e transferir para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50ml 4. Centrifugar 5min a 6000g e rejeitar o sobrenadante 5. Ressuspender em 1,5ml de solução de lítio 6. Misturar 200µg de DNA "carrier" com  5µg de DNA para transformar num microtubo (o volume total de DNA não deverá exceder 20µl) 7. Adicionar 200µl da suspensão celular 8. Adicionar 1,2ml de solução de PEG e incubar com agitação a 30°C durante 30min 9. Provocar choque térmico de 42°C durante, exactamente, 15min Estudo da regulação do gene STL1 codificando o sistema de simporte H+/glicerol em Saccharomyces cerevisiae  3 10. Centrifugar em microcentrífuga à máxima velocidade durante 5seg à temperatura ambiente 11. Ressuspender as células em 200µl de tampão TE e espalhar em placas contendo meio selectivo apropriado (YNBDA com suplementos auxotróficos convenientes) Meios de cultura e soluções • YPD Extracto de levedura 1% (p/v) Peptona 2% (p/v) Glucose 2% (p/v) • YNBDA (Yeast Nitrogen Base, Difco) YNB 0,67% (p/v) Glucose 2% (p/v) Agar 2% (p/v) Suplementos auxotróficos 40mg/L Preparar o YNB, glucose e suplementos auxotróficos em solução concentrada 10x e esterilizar por filtração. Adicionar ao agar mais água esterilizados por autoclavagem para fazer o volume total antes da distribuição pelas placas. • Solução de PEG (polietilenoglicol) PEG 4000 ou 3500 (esterilizado por filtração) 50% (p/v) 8vol. Tampão TE, pH 7,5 (10x) 1vol. Acetato de lítio (10x) • Solução de lítio Tampão TE, pH 7,5 (10x) 1vol. Acetato de lítio (10x) 1vol. Água ultra-pura esterilizada 8vol. • Tampão TE, pH 7,5 (10X) Tris.HCl 100mM, pH 7,5 EDTA 10mM, pH 7,5 • Acetato de lítio (10x): Acetato de lítio 1M, pH 7,5 ajustado com ácido acético diluído Esterilizar por filtração • Tampão TE, pH 7,5 Tris.HCl 10mM, pH 7,5 EDTA 1mM, pH 7,5 Preparação de amostras para microscopia de fluorescência Protocolo 1. Inocular meio SCGly-ura com a estirpe FVVY24 (MATa leu2-3, 112ura3-1 trp1-1  his3-11, 15 ade2-1 can1-100 stl1::kanMX) transformada com o plasmídeo pUG35-STL1 e incubar overnight a 30°C, 180 r.p.m. 2. Colher as células por centrifugação a 4000g, 5min. Fazer uma suspensão celular com OD600≈0,25 em meio SCGly-ura fresco 3. Colher as células a meio da fase exponencial de crescimento (OD600≈0,6) e transferir para meio SCGly-ura sem metionina e incubar durante 1-2h 4. Colher as células por centrifugação e separar uma alíquota para visualização por microscopia de fluorescência 5. Suspender as restantes células em SCGluc-ura contendo metionina e incubar durante 1h 6. Colher as células para visualização por microscopia de fluorescência Meios de cultura • SCGly-ura Ácido succínico 1% (p/v) Estudo da regulação do gene STL1 codificando o sistema de simporte H+/glicerol em Saccharomyces cerevisiae  4 YNB w/o amino acids (Difco) 0,67% (p/v) Glicerol 2% (p/v) Suplementos auxotróficos 40mg/L • SCGluc-ura Ácido succínico 1% (p/v) YNB w/o amino acids (Difco) 0,67% (p/v) Glucose 2% (p/v) Suplementos auxotróficos 40mg/L “Western blots” Protocolo 1. Inocular meio de cultura YPD com a estirpe FVVY28 (MATa leu2-3, 112ura3-1 trp1-1  his3-11, 15 ade2-1 can1-100 stl1::STL1-2ZZ kanMX) e incubar a 30°C, 180r.p.m. 2. Colher as células correspondentes a DO600=1 durante a fase exponencial de crescimento (OD600≈0,3-0,4) por centrifugação a 4000g, 5min (considerar 1ml o volume de cultura usado para as medições de DO600) 3. Ressupender o sedimento em 200µl de NaOH 0,2M e β-mercaptoetanol 2% 4. Incubar 10min a 4°C 5. Precipitar proteínas com 200µl de ácido tricloroacético (TCA) 10% (usar luvas) 6. Centrifugar a 14000r.p.m., 10min 7. Lavar duas vezes o sedimento com 200µl de acetona 8. Incubar 10min a 4°C para evaporação da acetona restante 9. Dissolver as proteínas com 100µl de tampão de amostra/duodecil sulfato de sódio (SDS) 10. Incubar 10min a 95°C (furar a tampa do microtubo) Neste ponto do protocolo, as amostras podem ser congeladas a -20°C para análise posterior (neste caso deve-se incubar novamente 10min a 95°C antes da aplicação no gel de electroforese) ou usadas para aplicação directa no gel para electroforese. 11. Proceder à montagem do sistema de electroforese com espaçadores de 0,75mm 12. Preparar o gel separador e aplicar no sistema com uma pipeta Pasteur logo após a adição de TEMED. Cobrir a superfície exposta do gel com água e deixar polimerizar 30-60min à temperatura ambiente 13. Retirar a água sobreposta ao gel, preparar o gel de concentração e aplicar logo após a adição do TEMED até à parte superior do contentor. Colocar o pente de 0,75mm de espessura e deixar polimerizar o gel 30-45min à temperatura ambiente 14. Aplicar as amostras nos poços respectivos (15-20µl) 15. Separar as proteínas das amostras por SDS-PAGE (12%) 16. Transferir para membranas de nitrocelulose Mergulhar a membrana em TBS-T (TBS com 0,1% Tween 20) com 5% de leite magro em pó para bloqueamento de locais de ligação não específica. Agitar durante 1h à temperatura ambiente 17. Lavar a membrana duas vezes com TBS-T 18. Diluir 1/100 o anticorpo conjugado com a peroxidase com TBS 30min antes da utilização 19. Incubar as membranas com o imunocomplexo solúvel peroxidase e anticorpo antiperoxidase de coelho (PAP, Dako-Cytomation) 20. Lavar brevemente duas vezes a membrana com TBS-T e incubar 15min em excesso de TBS-T à temperatura ambiente 21. Fazer mais 3 lavagens da membrana com TBS-T, 5min à temperatura ambiente 22. Revelar as reacções com “ECL Plus Western Blotting Detection System" (Amersham Biosciences); anexo 3 Estudo da regulação do gene STL1 codificando o sistema de simporte H+/glicerol em Saccharomyces cerevisiae  5 Meios de cultura e reagentes • Tampão de amostra/SDS (2x) Tris HCl 0,125M + SDS 0,1% (p/v), pH 6,8 Glicerol 20% (v/v) SDS 4% (p/v) β-mercaptoetanol 2% (v/v) • Gel separador (12%) 3ml acrilamida/bisacrilamida (30:0,8) 950µl tampão Tris 3M, pH 8,8 3,22ml água 75µl SDS 10% 250µl persulfato de amónio (PSA) 10% 5µl N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina (TEMED) • Gel de concentração (4%) 250µl acrilamida/bisacrilamida (30:0,8) 500µl tampão Tris 3M, pH 8,8 1,13ml água 2µl SDS 10% 100µl PSA 10% 2µl  TEMED • Tampão de aplicação Tris.HCl 125mM Glicerol 20% SDS 4% Azul de bromofenol 0,01% β-mercaptoetanol 1% (pH 6,8) • TBS 8g NaCl 20ml Tris HCl 1M, pH 7,6 Diluir com água desionizada para 1000ml (verificar pH) • Solução de Coomassie Metanol 50% Ácido acético 10% Coomassie R258 0,25% • Solução de descoloração Metanol 25% Ácido acético 5% Estudo da regulação do gene STL1 codificando o sistema de simporte H+/glicerol em Saccharomyces cerevisiae  6 Anexo 1  Estudo da regulação do gene STL1 codificando o sistema de simporte H+/glicerol em Saccharomyces cerevisiae  7 Anexo 2  Estudo da regulação do gene STL1 codificando o sistema de simporte H+/glicerol em Saccharomyces cerevisiae  8 Anexo 3  

Estudo da regulação do gene STL1 codificando o sistema de simporte H+/glicerol em Saccharomyces cerevisiae : protocolos

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Estudo da regulação do gene STL1 codificando o sistema de simporte H+/glicerol em Saccharomyces cerevisiae : protocolos

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