Protocolos dos trabalhos laboratoriais da disciplina de Biociências do Mestrado em Supervisão Pedagógica do Ensino da(s) Ciências da Natureza/Biologia e Geologia, ano lectivo de 2004/2005

Oliveira, Rui Pedro Soares de

Universidade do Minho: RepositoriUM

  Mestrado em Supervisão Pedagógica em Ensino da(s) Ciências da Natureza/Biologia e Geologia Ano lectivo de 2004/2005          Disciplina de Biociências (módulos de Biologia Celular, Conceitos de Genética e Conceitos de Biologia Molecular e Genómica) Docente: Rui Oliveira Mestrado em Supervisão Pedagógica em Ensino da(s) Ciências da Natureza/Biologia e Geologia Protocolos dos trabalhos laboratoriais da disciplina de Biociências  2 Trabalho prático nº1: Extracção de DNA de vários materiais biológicos Protocolo  Mater ia l  (por grupo) 1 proveta de 100ml 1 almofariz 1 espátula 1 balança 1 bisturi ou faca 1 pinça Folha de alumínio Copo de 250-500ml Banho de água a 60ºC Banho de gelo 1 funil 1 suporte para funil Papel de filtro 1 copo de 200ml 2 varetas de vidro 2 provetas de10ml 1 tubo de ensaio 1 suporte para tubos de ensaio 100ml de solução de extracção de DNA (sal 2% p/v, detergente 10% v/v) 10ml de álcool (gelado) Procedimento 1. Remover a parte exterior do material biológico com o bisturi, cortar em pedaços pequenos e pesar cerca de 30g. 2. Colocar o material num almofariz e homogeneizar. 3. Adicionar 100ml de solução de extracção de DNA e transferir todo o material para um copo de 250-500ml. 4. Colocar o copo num  banho maria a 60ºC durante 10-15min com agitação ocasional para distribuir o calor. 5. Transferir o copo para um banho de gelo e manter durante 5min com agitação ocasional. 6. Filtrar a mistura de extracção por um filtro de pregas e recolher o filtrado num copo de 200ml. 7. Transferir 5ml do filtrado para um tubo de ensaio e adicionar álcool gelado lentamente de modo a não se misturar com o extracto. 8. Colocar o tubo de ensaio num suporte e observar e anotar o que acontece na zona de contacto entre o extracto e o álcool. 9. Manter o tubo na mesma posição durante 2min e recolher o DNA com uma vareta de vidro. Fazer a análise crítica do protocolo e dos resultados. Elaborar duas questões para discussão. Tópicos de discussão: • Qual é o objectivo do uso de detergente? • Como é que se adaptaria este procedimento para extracção de DNA de sangue? Qual a utilidade desta extracção? Mestrado em Supervisão Pedagógica em Ensino da(s) Ciências da Natureza/Biologia e Geologia Protocolos dos trabalhos laboratoriais da disciplina de Biociências  3 • O núcleo de cada célula humana tem cerca de 2m de DNA. Tente arranjar uma explicação sobre o arranjo do DNA nos núcleos celulares. • Haverá contaminantes no DNA obtido? Trabalho prático nº2: Análise de DNA por electroforese em gel de agarose Protocolo Mater ia l  Erlenmeyer de 250ml Espátula Balança Microondas Tina de electroforese Fonte de electroforese Micropipetas P20 e P100 Pontas para micropipeta amarelas Microtubos Transiluminador de UV Tampão TAE (solução 50x: tris base 242g; ácido acético glacial 57,1ml; EDTA 0,5M, pH 8,0, 100ml; água desionizada q.b.p. 1000ml) Água ultra-pura Tampão de amostra (solução 6x: azul de bromofenol 0,25% p/v; xileno de cianol FF 0,25% p/v; glicerol 30% p/v) Brometo de etídeo 0,5µg/ml Procedimento Preparação do gel de agarose 1. Preparar uma solução de agarose em tampão TAE com concentração final de  0,8% (p/v). Aquecer a mistura em microondas, com agitação frequente, até  toda a agarose se ter dissolvido. 2. Colocar o tabuleiro da tina de electroforese no respectivo suporte de  preparação do gel ou, na sua falta, selar com fita adesiva de autoclave.  3. Colocar o pente em posição conveniente no tabuleiro para um correcto  posicionamento dos poços: distância à extremidade e à base do gel. 4. Verter a agarose no tabuleiro até uma altura de ~5mm. Eliminar bolhas de ar  que se tenham formado, aspirando com uma micropipeta e deixar solidificar à  temperatura ambiente. 5. Quando o gel se tiver formado, retirar lentamente o pente para não danificar os poços, colocar o tabuleiro na tina de electroforese, de modo a que os poços  estejam do lado do eléctrodo negativo, e adicionar tampão TAE até ~1mm  acima do gel. Preparação das amostras 6. Para cada amostra, misturar num microtubo: 100-500ng de DNA, 4µl de tampão de amostra (5x conc.) e água ultra-pura q.b.p. 20µl. 7. Aplicar as amostras nos respectivos poços, enchendo lentamente cada poço com uma micropipeta. Não deixar extravasar a amostra do poço para não contaminar os poços vizinhos. 8. Colocar a tampa da tina. Verificar que as amostras estão colocadas do lado do polo negativo (cátodo, eléctrodo de cor preta) e que a migração será no sentido do polo positivo (ánodo, eléctrodo de cor vermelha). Mestrado em Supervisão Pedagógica em Ensino da(s) Ciências da Natureza/Biologia e Geologia Protocolos dos trabalhos laboratoriais da disciplina de Biociências  4 9. Ligar os cabos à fonte de electricidade. Ligar a fonte e regular para uma voltagem de 1-5V/cm (distância medida entre os eléctrodos). Verificar se há desprendimento de bolhas dos eléctrodos devido à electrólise e se, passados alguns minutos, o azul de bromofenol já começou a migrar no sentido correcto. 10. Após migação julgada conveniente (por avaliação da posição do azul de bromofenol a sensivelmente 3/4 do comprimento do gel), desligar a corrente eléctrica na fonte, desligar os cabos e retirar a tampa da tina. Retirar o gel cuidadosamente para não partir e corá-lo em banho numa solução de brometo de etídeo 0,5µg/ml, durante 30-45min à temperatura ambiente. O brometo de etídeo é um agente mutagénico potente, usar sempre luvas e colocar em recipiente próprio todo o material que tenha entrado em contacto com este corante 11. Examinar o gel à radiação ultra-violeta e fotografar para arquivar. As radiações U.V. são extremamente perigosas, particularmente para os olhos, provocando lesões na retina. Evitar qualquer exposição dos olhos a estas radiações. Usar sempre óculos protectores ou máscaras de material opaco aos U.V. Fazer a análise crítica do protocolo e dos resultados. Elaborar duas questões para discussão 

Disciplina de biociências: módulos de biologia celular, conceitos de genética e conceitos de biologia molecular e genómica

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