Thesis for Doctoral (degree in Textile
Engineering Textile Chemistry)The background theme of the present thesis is the multidisciplinary area of textile
biotechnology, which is of major importance for the textile industry and its sustainable
development. The work here described was devoted to the treatment with enzymes of two manmade
fibres - acrylic and cellulose acetate. The thesis is divided in several chapters being the
first one a general introduction. Biocatalysis is addressed, especially in the context of textile
industry and surface modification of polymers, followed by a general description on the
properties and applications of both fibres. The enzymes used throughout the work – nitrilase
(EC 3.5.5.1) and cutinase (EC 3.1.1.74), are briefly mentioned as well as the major methods to
manipulate and improve enzymes. The general aim of the work is the formation of reactive
and/or hydrophilic groups at the surface of acrylic and cellulose acetate fibres by enzymatic
hydrolysis of their pendent groups. As follows, the purpose is to preserve the desirable bulk
properties of the fibres acting only at the surface by using eco-friendly catalysts.
In chapter 2, the modification of the surface of acrylic fabric with a commercial nitrilase is
reported. The enzymatic conversion of nitrile groups into the carboxylic groups, on the fibre
surface, was monitored for 36 hours by the release of ammonia to the media and by the
improvement in the affinity of the treated fabric for a basic dye. The steady release of ammonia
along the enzymatic treatment showed that the adsorption of nitrilase to the acrylic led to an
increase in its operational stability, resembling the immobilization procedures used to stabilize
proteins. A maximum affinity for the basic dye was observed for a treatment period of 8 hours,
which corresponded to a relative K/S of 135% when the colouration of acrylic was performed at
70 ºC. A surface erosion phenomenon took place causing the “oscillatory” behaviour of the
amount of dye uptake with the time of treatment. Polyacrylic acid was determined in solution as
a non desirable, secondary product of the modification of acrylic with nitrilase. These results
showed that the outcome of nitrilase application is closely dependent on reaction parameters
like time, enzyme activity and media formulation.
The chapter 3 describes the modification of the comonomer vinyl acetate of the acrylic
used with two enzymes: cutinase from the fungus Fusarium solani pisi and a commercial
esterase (Texazym PES). The effect of acrylic solvents and stabilizing polyalcohols on cutinase
operational stability in solution was studied. The influence of these additives and mechanical
agitation on the enzymatic modification of acrylic fabric was also investigated. The hydroxyl
groups produced on the fibre surface reacted with the dye Remazol Brilliant Blue R, C.I. 61200,
increasing the colour of treated fabric. The best colour level was obtained with a high level of
mechanical agitation and with the addition of 1% (v/v) N,N-dimethylacetamide. Under these
conditions, the increase in the acrylic fabric colour depth was around 30% for cutinase and 25%
for Texazym, comparing to the respective controls. The crystallinity degree, determined by wide
angle X-ray scattering, was not significantly changed between control samples and samples treated with cutinase. The results showed, once more, that the success of the application of
enzymes, in this case cutinase and a commercial esterase, depends closely on the conditions in
which the treatment takes place.
Cutinase was also chosen to modify the surface of cellulose diacetate and triacetate
fibres. This work is reported in chapter 4. The enzymatic hydrolysis of acetyl groups on the fibre
surface was evaluated by the release of acetic acid and by the specific chemical colouration of
the fabrics with Remazol Brilliant Blue R. The treatment for 8 hours, at 30 ºC and pH 8, resulted
in an acetyl esterase activity of 0.010 U and 0.0072 U on cellulose diacetate and triacetate,
respectively. The colour levels for samples treated with cutinase for 24 hours increased 25% for
cellulose diacetate and 317% for cellulose triacetate, comparing to the controls. Cross-sections
of both fibres were analysed by fluorescence microscopy and the superficial action of cutinase
was confirmed. Comparing to other enzymes described in literature, cutinase is a catalyst to
consider for the superficial regeneration of cellulose hydrophilicity and reactivity on highly
substituted acetates.
For further improvement of cutinase activity on cellulose modified fibres, chimeric
cutinases were produced, by recombinant DNA technologies, and used to treat cellulose
acetate fabrics, as described in chapter 5. Two distinct carbohydrate-binding modules were
fused independently to the C-terminal of cutinase: the carbohydrate-binding module of
cellobiohydrolase I, from the fungus Trichoderma reesei, and the carbohydrate-binding module
of endoglucanase C, from the bacterium Cellulomonas fimi. Both chimeric cutinases had a more
efficient performance than the wild type enzyme, but the interaction of these bifunctional
enzymes with cellulose acetate needs to be further characterized for a better assessment of the
nature and yield of the observed modifications.
The chapter 6 is dedicated to the general discussion, final remarks and future
perspectives. In this thesis, evidences are presented showing that enzymes, more specifically,
nitrilase and cutinase are important tools for the acrylic and cellulose acetate surface
functionalization. This work also evidenced that this is only the first step towards the efficient
utilization of these resources that Nature provide us.O tema de fundo deste trabalho é a área multidisciplinar da biotecnologia têxtil que tem
vindo a afirmar-se como uma área de grande importância para a indústria têxtil e para o seu
desenvolvimento sustentável. O trabalho aqui apresentado consistiu no tratamento com
enzimas de duas fibras, a acrílica e o acetato de celulose. A tese encontra-se dividida em
vários capítulos consistindo o primeiro numa introdução geral a diversos tópicos abordados
pelo trabalho. A biocatálise é referida, especialmente, no contexto da indústria têxtil e
modificação superficial de polímeros, seguida de uma descrição geral das propriedades e
aplicações das duas fibras. As enzimas utilizadas ao longo do trabalho – nitrilase (EC 3.5.5.1) e
cutinase (EC 3.1.1.74), são mencionadas de forma sucinta assim como os métodos principais
de manipulação da actividade enzimática. O objectivo geral do trabalho assentou no
desenvolvimento de metodologias não poluentes conducentes à formação de grupos
reactivos/hidrofílicos à superfície das fibras, via hidrólise dos grupos laterais dos respectivos
polímeros de forma a preservar as propriedades nucleares e desejáveis das fibras.
No capítulo 2 é reportada a modificação da superfície da fibra acrílica por uma nitrilase
comercial. A conversão enzimática dos grupos nitrilo em grupos carboxílicos à superfície da
fibra foi avaliada durante 36 horas através da libertação de amoníaco para a solução e através
do aumento da afinidade do tecido tratado para um corante básico. O aumento linear do
amoníaco, libertado durante o tratamento, mostrou que a adsorção da nitrilase à fibra acrílica
conduziu a um aumento da sua estabilidade operacional assemelhando-se aos procedimentos
de imobilização usados para estabilizar enzimas. Um valor máximo de K/S foi observado para
um período de incubação de 8 horas, o que corresponde a um K/S relativo de 135% quando se
fez uma coloração a 70 ºC. Teve lugar um fenómeno de erosão superficial que determinou o
comportamento oscilatório da quantidade de corante fixada com o tempo de tratamento. Foi
determinado ácido poliacrílico nas soluções de tratamento como produto secundário não
desejado da modificação da acrílica pela nitrilase. Estes resultados revelam que o efeito final
da aplicação da nitrilase no tratamento da acrílica está intimamente dependente dos
parâmetros da reacção como o tempo, a actividade da enzima e a composição do meio.
O capítulo 3 descreve a modificação do comonómero acetato de vinilo da fibra acrílica
usada pela acção da cutinase do fungo Fusarium solani pisi e de uma esterase comercial
(Texazym PES). Foi estudado o efeito de solventes da acrílica e de poli-álcoois na estabilidade
operacional da cutinase em solução, bem como o impacto desses aditivos e da agitação
mecânica na modificação enzimática do tecido de acrílica. Os grupos hidroxilo produzidos na
superfície da fibra reagiram com o corante Remazol Brilliant Blue R, C.I. 61200, aumentando a
cor do tecido tratado. O melhor nível de coloração foi obtido com elevada agitação mecânica e
com a adição de 1% (v/v) de N,N-dimetilacetamida. Sob estas condições, o aumento da
intensidade de cor, em relação aos controlos, foi de 30% para o tratamento com a cutinas e 25% para a Texazym. O grau de cristalinidade determinado por difracção de raios-X não foi
alterado significativamente entre amostras controlo e amostras tratadas com cutinase. Uma vez
mais, os resultados mostraram que o sucesso da aplicação de enzimas, neste caso a cutinase
e uma esterase comercial, depende muito das condições em que se realiza o tratamento.
A cutinase foi escolhida para modificar também a superfície de fibras de diacetato e
triacetato de celulose, trabalho este que é abordado no capítulo 4. A hidrólise enzimática dos
grupos acetilo na superfície da fibra foi monitorizada pela libertação de ácido acético e pela
coloração específica dos tecidos com o corante Remazol Brilliant Blue R. O tratamento do
tecido durante 8 horas a 30 ºC e pH 8 resultou numa actividade acetil esterase de 0.010 U e
0.0072 U tendo como substrato a fibra de diacetato e triacetato de celulose, respectivamente.
Os níveis de cor das amostras tratadas com cutinase durante 24 horas aumentaram 25% para
o diacetato e 317% para o triacetato, comparando com os controlos. Foram analisadas secções
transversais de ambas as fibras, por microscopia de fluorescência, e confirmou-se a acção
superficial da cutinase. Por comparação com outras enzimas já descritas, a cutinase é um
catalizador a ter em consideração para a regeneração superficial da hidrofilicidade e
reactividade da celulose em acetatos com grau de substituição elevado.
Para melhorar a actividade da cutinase nas fibras modificadas de celulose foram
produzidas, através de tecnologias de ADN recombinante, cutinases quiméricas que foram,
posteriormente, usadas no tratamento dos tecidos de acetato de celulose descrito no capítulo
5. Dois módulos distintos de ligação a carbohidratos foram fundidos, independentemente, ao
terminal carboxílico da cutinase: o módulo da celobiohidrolase I, do fungo Trichoderma reesei e
o da endoglucanase C, da bactéria Cellulomonas fimi. Ambas cutinases quiméricas tiveram
uma performance mais eficiente que a cutinase nativa, mas a interacção destas enzimas
bifuncionais com os acetatos de celulose carece de mais estudos para melhor caracterizar a
natureza e extensão destas modificações.
O capítulo 6 é dedicado a uma discussão geral, observações finais e perspectivas
futuras. Nesta tese são apresentadas evidências que mostram que as enzimas, mais
concretamente, a nitrilase e a cutinase são ferramentas importantes para a funcionalização da
superfície das fibras acrílicas e de acetato de celulose. Com este trabalho também fica claro
que apenas se deu o primeiro passo num percurso que eventualmente nos conduzirá a um
aproveitamento eficiente destes recursos que a Natureza nos providencia.eFundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)
by means of a PhD grant (SFRH / BD / 13423 / 2003BioSYNTEX (G5RD-CT-2001-00560) from the European Union 5th FrameworkProgram - GROWT