thesis

Characterization of monocarboxylate permeases in yeast : functional and structural analysis

Abstract

Os ácidos carboxílicos de cadeia curta são compostos importantes produzidos de forma natural no decorrer de numerosos processos metabólicos, para além de poderem ser utilizados como única fonte de carbono e energia por diversos seres vivos, incluindo leveduras. É neste contexto que o estudo das permeases de monocarboxilatos se reveste de especial importância, dado que o transporte destes nutrientes através da membrana é um factor essencial no metabolismo da grande maioria das células. Com o trabalho descrito na presente tese procurou-se desenvolver o conhecimento actual sobre permeases de monocarboxilatos de leveduras, através de um aprofundamento do estudo da permease de lactato/piruvato de Saccharomyces cerevisiae codificada pelo gene JEN1. A primeira etapa deste trabalho consistiu na expressão heteróloga do gene JEN1 na levedura Pichia pastoris. Este gene foi clonado num vector do tipo integrativo (pPICZB) assim como num vector replicativo vector (pZPARS), e posteriormente expresso em duas estirpes diferentes, Mut+ e Muts. A confirmação da expressão do gene JEN1 foi efectuada em células induzidas 24 horas em metanol tanto ao nível do mRNA como ao nível proteico. A actividade máxima da permease obtida em células de P. pastoris apresentou um Vmax de 2,1 nmol s-1 mg-1 peso seco. Este valor representou um aumento de cinco vezes comparativamente com os parâmetros descritos na literatura para células da estirpe selvagem crescidas em lactato. Numa segunda fase, a actividade da permease foi reconstituída em vesículas híbridas, obtidas por fusão de membranas extraídas a partir de células de P. pastoris induzidas em metanol e lipossomas de Escherichia coli contendo citocromo c oxidase, como proteína geradora de uma força proto-motriz. A actividade da proteína reconstituída apresentou propriedades semelhantes à proteína selvagem de S. cerevisiae no que diz respeito ao simporte de protões como mecanismo acoplado ao transporte de lactato e também aos inibidores testados. Com este trabalho foi possível demonstrar a funcionalidade da proteína Jen1 de S. cerevisiae como sendo um transportador de lactato. A caracterização molecular de outros genes codificantes de permeases de monocarboxilatos levou-nos ao estudo do transporte de ácidos monocarboxílicos na levedura Candida albicans. A presença de uma permease de monocarboxilatos foi identificada em células da estirpe C. albicans RM1000 crescidas em lactato. Estudos de inibição demonstraram que o transporte de lactato é inibido competitivamente por piruvato e propionato, mas não por acetato que se revelou ser um inibidor não competitivo. Uma pesquisa de homólogos do gene ScJEN1 em C. albicans revelou a existência de uma ORF com 61% de similaridade que foi designada por CaJEN1. Deleções de ambos os alelos de C. albicans originaram uma ausência de detecção do CaJEN1 mRNA e da actividade da permease. Em células da estirpe selvagem C. albicans RM1000 crescidas em glucose não se verificou expressão do CaJEN1 assim como não foi possível detectar actividade da permease. A expressão heteróloga do gene CaJEN1 foi efectuada na estirpe S. cerevisiae jen1Δ, mas não foi recuperado o transporte de ácido láctico. A levedura C. albicans possui uma alteração no código genético o que faz com que a proteína CaJen1 ao ser expressa em S. cerevisiae possua uma mutação S217L. Foi aplicada a técnica de mutagénese dirigida de forma a restabelecer a sequência proteica original, sendo desta forma recuperada actividade da permease em S. cerevisiae. Com este estudo confirmou-se que o gene CaJEN1 codifica um transportador de monocarboxilatos em C. albicans. Estudos adicionais com uma estirpe deletada no gene CaCAT8 demonstraram que a expressão deste gene influencia a expressão do CaJEN1, fenómeno idêntico ao que se verifica com os correspondentes genes homólogos de S. cerevisisae. Na última parte do trabalho efectuou-se uma pesquisa de domínios da ScJen1p envolvidos no reconhecimento/transporte do substrato. Foi efectuada uma análise por mutagénese da sequência 379NXX[S/T]HX[S/T]QDXXXT391 em cinco dos aminoácidos conservados. A substituição dos resíduos N379, H383 ou D387, mesmo que por aminoácidos muito similares, provocou uma acentuada redução do transporte de lactato e piruvato mas manteve transporte de acetato mensurável. Ensaios de inibição de transporte de acetato demonstraram que estes mutantes têm a capacidade de ligar mas não de transportar lactato e piruvato. Ensaios de transporte com o duplo mutante H383D/D387H demonstraram a existência de interacções entre estes dois aminoácidos, dado que este exibe uma perda de função para o transporte de lactato e piruvato mas apresenta parâmetros cinéticos idênticos ao Jen1p para o transporte de acetato. As mutações nos resíduos N379, H383 e D387 afectam simultaneamente a capacidade de transporte e a especificidade da Jen1p. Quanto aos aminoácidos Q386 eT391 o seu efeito parece ser mais ao nível da afinidade de ligação ao substrato do que na capacidade de transporte. Na sua globalidade estes resultados sugerem que a sequência aqui estudada intervém na via de translocação do substrato da permease de lactato/piruvato de S. cerevisiae.Short chain carboxylic acids are important compounds that result from normal cell metabolism and that can be used as sole carbon and energy source by different organisms. In this context the study of monocarboxylate permeases is of great significance since the uptake of these nutrients across cellular membranes is essential for the metabolism of most cells. With the work presented in this thesis we seek to increase the current knowledge on yeast monocarboxylate permeases by studying the Saccharomyces cerevisiae lactate/pyruvate proton symporter, encoded by the JEN1gene. The first step of this work was the heterologous expression of the JEN1 gene in Pichia pastoris. JEN1 was cloned in an integrative vector (pPICZB) and a replicative vector (pZPARS), and expressed in two different strains, Mut+ and Muts. JEN1 expression was confirmed in 24 hour methanol-induced cells both at mRNA and protein level. Maximum lactate permease activity was obtained in P. pastoris cells with a Vmax of 2.1 nmol s-1 mg-1 dry weight, representing a 5 fold increase in the permease activity when compared to the wild-type lactate-grown cells. In the second part of this work the lactate permease activity was reconstituted in hybrid vesicles, obtained by fusion of plasma membranes from P. pastoris methanol-induced cells with Escherichia coli liposomes containing cytochrome c oxidase, as proton-motive force. The reconstituted lactate uptake activity presented similar properties with those of the permease evaluated in S. cerevisiae in what concerns the proton symporter mechanism and the inhibitors tested. This work demonstrated that S. cerevisiae Jen1p is a fully functional lactate transporter. The molecular identification of other genes encoding monocarboxylate permeases led us to study the uptake of monocarboxylates in the yeast Candida albicans. A lactate permease was biochemically identified in C. albicans RM1000 lactate-grown cells. Inhibition assays demonstrated that lactate uptake was competitively inhibited by pyruvic and propionic acids but not by acetic acid, that behaved as a non-competitive substrate. A ScJEN1 homologue search within the C. albicans genome revealed the existence of an ORF possessing 61% similarity, that was named CaJEN1. Deletions of both CaJEN1 alleles resulted in absence of mRNA detection and in the lack of measurable lactate uptake. In the presence of glucose no CaJEN1 expression and lactate permease activity were detected. Heterologous expression of CaJEN1 was performed in S. cerevisiae jen1Δ strain, but no activity for the permease was achieved with the native CaJEN1 gene. Due to a difference in the C. albicans genetic code, site directed mutagenesis was performed to re-establish the CaJen1p codon 217 as a serine when expressed in S. cerevisiae, and permease activity was recovered. This was the confirmation that the CaJEN1 gene codes for a monocarboxylate transporter. Additionally, studies with a CaCAT8 deletion strain demonstrated that the CaJEN1 transcription level is influenced by the expression of this gene, in a similar way to what happens to the corresponding S. cerevisiae homologs. The last part of this work was dedicated to the search for ScJen1p domains involved in substrate recognition/transport. This was performed using a mutational analysis of the conserved sequence 379NXX[S/T]HX[S/T]QDXXXT391. The study focused on five amino acids, charged or polar, and highly conserved. Substitution of amino acid residues N379, H383 or D387, even with very similar amino acids, resulted in a very dramatic reduction of lactate and pyruvate uptake, but conserved measurable acetate transport. Acetate transport inhibition assays showed that these mutants conserve the ability to bind but not transport lactate and pyruvate. The double mutant H383D/D387H, demonstrated the existence of an interaction between these two aminoacids, since it behaves as a total loss-of-function allele for lactate and pyruvate uptake, but fully restores the kinetic parameters of Jen1p for acetate transport. Thus, residues N379, H383 or D387 affect both the transport capacity and the specificity of Jen1p. The Q386 and T391 residues seem to contribute more for substrate binding affinity than transport capacity. Overall the results obtained suggest that the conserved sequence here studied is part of the substrate translocation pathway in the S. cerevisiae proton symporter monocarboxylate permease.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) - SFRH/BD/4699/2001

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