Os ácidos carboxílicos de cadeia curta são compostos importantes produzidos de
forma natural no decorrer de numerosos processos metabólicos, para além de poderem ser utilizados como única fonte de carbono e energia por diversos seres vivos, incluindo leveduras. É neste contexto que o estudo das permeases de monocarboxilatos se reveste de especial importância, dado que o transporte destes nutrientes através da membrana é um factor essencial no metabolismo da grande maioria das células. Com o trabalho descrito na presente tese procurou-se desenvolver o conhecimento actual sobre permeases de monocarboxilatos de leveduras, através de um aprofundamento do estudo da permease de lactato/piruvato de Saccharomyces cerevisiae codificada pelo gene JEN1.
A primeira etapa deste trabalho consistiu na expressão heteróloga do gene JEN1
na levedura Pichia pastoris. Este gene foi clonado num vector do tipo integrativo
(pPICZB) assim como num vector replicativo vector (pZPARS), e posteriormente
expresso em duas estirpes diferentes, Mut+ e Muts. A confirmação da expressão do gene
JEN1 foi efectuada em células induzidas 24 horas em metanol tanto ao nível do mRNA
como ao nível proteico. A actividade máxima da permease obtida em células de P.
pastoris apresentou um Vmax de 2,1 nmol s-1 mg-1 peso seco. Este valor representou um
aumento de cinco vezes comparativamente com os parâmetros descritos na literatura
para células da estirpe selvagem crescidas em lactato. Numa segunda fase, a actividade
da permease foi reconstituída em vesículas híbridas, obtidas por fusão de membranas
extraídas a partir de células de P. pastoris induzidas em metanol e lipossomas de
Escherichia coli contendo citocromo c oxidase, como proteína geradora de uma força proto-motriz. A actividade da proteína reconstituída apresentou propriedades
semelhantes à proteína selvagem de S. cerevisiae no que diz respeito ao simporte de
protões como mecanismo acoplado ao transporte de lactato e também aos inibidores
testados. Com este trabalho foi possível demonstrar a funcionalidade da proteína Jen1
de S. cerevisiae como sendo um transportador de lactato.
A caracterização molecular de outros genes codificantes de permeases de
monocarboxilatos levou-nos ao estudo do transporte de ácidos monocarboxílicos na
levedura Candida albicans. A presença de uma permease de monocarboxilatos foi
identificada em células da estirpe C. albicans RM1000 crescidas em lactato. Estudos de
inibição demonstraram que o transporte de lactato é inibido competitivamente por
piruvato e propionato, mas não por acetato que se revelou ser um inibidor não
competitivo. Uma pesquisa de homólogos do gene ScJEN1 em C. albicans revelou a
existência de uma ORF com 61% de similaridade que foi designada por CaJEN1.
Deleções de ambos os alelos de C. albicans originaram uma ausência de detecção do
CaJEN1 mRNA e da actividade da permease. Em células da estirpe selvagem C.
albicans RM1000 crescidas em glucose não se verificou expressão do CaJEN1 assim
como não foi possível detectar actividade da permease. A expressão heteróloga do gene
CaJEN1 foi efectuada na estirpe S. cerevisiae jen1Δ, mas não foi recuperado o
transporte de ácido láctico. A levedura C. albicans possui uma alteração no código
genético o que faz com que a proteína CaJen1 ao ser expressa em S. cerevisiae possua uma mutação S217L. Foi aplicada a técnica de mutagénese dirigida de forma a
restabelecer a sequência proteica original, sendo desta forma recuperada actividade da
permease em S. cerevisiae. Com este estudo confirmou-se que o gene CaJEN1 codifica
um transportador de monocarboxilatos em C. albicans. Estudos adicionais com uma
estirpe deletada no gene CaCAT8 demonstraram que a expressão deste gene influencia a expressão do CaJEN1, fenómeno idêntico ao que se verifica com os correspondentes genes homólogos de S. cerevisisae.
Na última parte do trabalho efectuou-se uma pesquisa de domínios da ScJen1p
envolvidos no reconhecimento/transporte do substrato. Foi efectuada uma análise por
mutagénese da sequência 379NXX[S/T]HX[S/T]QDXXXT391 em cinco dos
aminoácidos conservados. A substituição dos resíduos N379, H383 ou D387, mesmo
que por aminoácidos muito similares, provocou uma acentuada redução do transporte de lactato e piruvato mas manteve transporte de acetato mensurável. Ensaios de inibição de transporte de acetato demonstraram que estes mutantes têm a capacidade de ligar mas não de transportar lactato e piruvato. Ensaios de transporte com o duplo mutante H383D/D387H demonstraram a existência de interacções entre estes dois aminoácidos, dado que este exibe uma perda de função para o transporte de lactato e piruvato mas apresenta parâmetros cinéticos idênticos ao Jen1p para o transporte de acetato. As mutações nos resíduos N379, H383 e D387 afectam simultaneamente a capacidade de transporte e a especificidade da Jen1p. Quanto aos aminoácidos Q386 eT391 o seu efeito parece ser mais ao nível da afinidade de ligação ao substrato do que na capacidade de transporte. Na sua globalidade estes resultados sugerem que a sequência aqui estudada intervém na via de translocação do substrato da permease de
lactato/piruvato de S. cerevisiae.Short chain carboxylic acids are important compounds that result from normal cell
metabolism and that can be used as sole carbon and energy source by different
organisms. In this context the study of monocarboxylate permeases is of great
significance since the uptake of these nutrients across cellular membranes is essential for the metabolism of most cells. With the work presented in this thesis we seek to increase the current knowledge on yeast monocarboxylate permeases by studying the Saccharomyces cerevisiae lactate/pyruvate proton symporter, encoded by the JEN1gene.
The first step of this work was the heterologous expression of the JEN1 gene in
Pichia pastoris. JEN1 was cloned in an integrative vector (pPICZB) and a replicative
vector (pZPARS), and expressed in two different strains, Mut+ and Muts. JEN1
expression was confirmed in 24 hour methanol-induced cells both at mRNA and protein level. Maximum lactate permease activity was obtained in P. pastoris cells with a Vmax of 2.1 nmol s-1 mg-1 dry weight, representing a 5 fold increase in the permease activity when compared to the wild-type lactate-grown cells. In the second part of this work the lactate permease activity was reconstituted in hybrid vesicles, obtained by fusion of plasma membranes from P. pastoris methanol-induced cells with Escherichia coli liposomes containing cytochrome c oxidase, as proton-motive force. The reconstituted lactate uptake activity presented similar properties with those of the permease evaluated
in S. cerevisiae in what concerns the proton symporter mechanism and the inhibitors
tested. This work demonstrated that S. cerevisiae Jen1p is a fully functional lactate
transporter.
The molecular identification of other genes encoding monocarboxylate permeases
led us to study the uptake of monocarboxylates in the yeast Candida albicans. A lactate permease was biochemically identified in C. albicans RM1000 lactate-grown cells.
Inhibition assays demonstrated that lactate uptake was competitively inhibited by
pyruvic and propionic acids but not by acetic acid, that behaved as a non-competitive substrate. A ScJEN1 homologue search within the C. albicans genome revealed the
existence of an ORF possessing 61% similarity, that was named CaJEN1. Deletions of both CaJEN1 alleles resulted in absence of mRNA detection and in the lack of
measurable lactate uptake. In the presence of glucose no CaJEN1 expression and lactate
permease activity were detected. Heterologous expression of CaJEN1 was performed in S. cerevisiae jen1Δ strain, but no activity for the permease was achieved with the native CaJEN1 gene. Due to a difference in the C. albicans genetic code, site directed mutagenesis was performed to re-establish the CaJen1p codon 217 as a serine when expressed in S. cerevisiae, and permease activity was recovered. This was the confirmation that the CaJEN1 gene codes for a monocarboxylate transporter.
Additionally, studies with a CaCAT8 deletion strain demonstrated that the CaJEN1
transcription level is influenced by the expression of this gene, in a similar way to what happens to the corresponding S. cerevisiae homologs.
The last part of this work was dedicated to the search for ScJen1p domains
involved in substrate recognition/transport. This was performed using a mutational
analysis of the conserved sequence 379NXX[S/T]HX[S/T]QDXXXT391. The study
focused on five amino acids, charged or polar, and highly conserved. Substitution of
amino acid residues N379, H383 or D387, even with very similar amino acids, resulted
in a very dramatic reduction of lactate and pyruvate uptake, but conserved measurable
acetate transport. Acetate transport inhibition assays showed that these mutants
conserve the ability to bind but not transport lactate and pyruvate. The double mutant
H383D/D387H, demonstrated the existence of an interaction between these two
aminoacids, since it behaves as a total loss-of-function allele for lactate and pyruvate
uptake, but fully restores the kinetic parameters of Jen1p for acetate transport. Thus, residues N379, H383 or D387 affect both the transport capacity and the specificity of Jen1p. The Q386 and T391 residues seem to contribute more for substrate binding affinity than transport capacity. Overall the results obtained suggest that the conserved
sequence here studied is part of the substrate translocation pathway in the S. cerevisiae proton symporter monocarboxylate permease.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) - SFRH/BD/4699/2001
