Tese de Doutoramento em Ciências da SaúdeA segmentação é o processo que conduz à formação dos sómitos, estruturas embrionárias metaméricas que se formam na parte mais rostral da mesoderme presomítica (MPS) e que estão na base da segmentação do corpo dos vertebrados. Sabese
actualmente que o processo de segmentação é controlado por um relógio molecular
que opera ao nível das células da MPS e que se manifesta pela transcrição cíclica de
vários genes, cujo tempo de ciclo corresponde precisamente ao tempo necessário para a formação de um sómito. O número de ciclos de expressão que ocorrem em cada célula pré-somítica confere-lhe uma informação temporal que se traduz numa informação posicional no eixo antero-posterior do embrião.
No curso desta tese de doutoramento, mostramos que ciclos de expressão dos
genes do relógio estão já a decorrer nas células do território somítico prospectivo. Este
estudo, realizado em embriões de galinha no estadio de 6 sómitos, também mostrou que
as futuras células medianas (Futura Mediana (FM)-MPS) e futuras células laterais (Futura
Lateral (FL)-MPS) dos sómitos se encontram em territórios distintos e organizados no
eixo antero-posterior da linha primitiva. O facto das oscilações dos genes cíclicos
atravessarem estes dois territórios ao longo deste eixo, implica que o relógio da
segmentação está a proporcionar uma informação posicional bidimensional (no eixo
antero-posterior e no eixo médio-lateral) às celulas da MPS. Notavelmente, bandas
oblíquas de expressão dos genes cíclicos foram também observadas na MPS.
Experiências de transplantação de tecidos efectuadas no nosso laboratório revelaram que apenas as células do território FM-MPS contêm a informação para segmentar, a qual
possivelmente lhes é transmitida pela região imediatamente anterior, denominada fenda
mediana (FM). Transplantes heterotópicos e interespecíficos da FM e células FM-MPS
entre a galinha e a codorniz permitiram-nos verificar que, de facto, a FM é um importante
centro sinalizador, responsável pela instrução das células vizinhas mais caudais no processo de segmentação.
Uma outra parte deste trabalho focou-se no estudo dos mecanismos moleculares
responsáveis por activar o início do relógio da segmentação durante o desenvolvimento
embrionário da galinha. Os nossos resultados mostraram que o relógio da segmentação não é activado por nenhum sinal derivado dos primeiros passos da formação do embrião,
e propuseram que o nó de Hensen poderia ser o responsável por iniciar o programa da
segmentação. O resultado de uma série de transplantes heterotópicos e isocrónicos do nó de Hensen revelaram que este transmite um sinal que é capaz de não só induzir as
oscilações dos genes cíclicos em células cujo destino não era a formação de sómitos, mas
também de reiniciar o programa da segmentação nestas células.
A parte final desta tese consistiu em estudar as diferenças entre os sómitos mais
anteriores e os sómitos mais posteriores do embrião. O facto dos sómitos mais rostrais
não originarem estruturas segmentadas e de o fenótipo de várias mutações que afectam a
somitogénese não apresentar defeitos ao nível destes sómitos, tem levado à ideia
generalizada que os sómitos anteriores são diferentes dos mais posteriores. Uma análise
detalhada da expressão de notch1, delta1, hairy1, hairy2, lunatic fringe and hey2 ao nível
dos primeiros 10 sómitos mostrou que a sua expressão não é a mesma ao longo do eixo
antero-posterior, e que as diferenças observadas não são sempre ao mesmo nível
somítico. Por outro lado, a monitorização da formação dos primeiros sómitos in vivo,
permitiu-nos concluir que os primeiros 2 sómitos se formam mais rapidamente, e de
forma quasi-concomitante, que os sómitos mais posteriores. No seu conjunto, os
resultados deste trabalho apontam para a existência de diferenças relevantes entre os
sómitos rostrais e caudais no que se refere às suas características moleculares e temporais no embrião de galinha.Segmentation is built on repetitive structures, named somites, which are formed
progressively from the most rostral part of presomitic mesoderm (PSM). This process is
controlled by a molecular clock operating at the level of the PSM, being evident by the
cyclic transcription of several genes. Remarkably, the transcription cycle of these genes is precisely the time required to form one somite.
In the course of this PhD thesis it was shown that the molecular clock underlying
somite formation already operates in the prospective somitic territory at 6-somite stage
embryos. Furthermore, this work demonstrated that at this stage the medial (PM-PSM) and lateral (PL-PSM) prospective PSM cells present clearly segregated territories in the primitive streak. Interestingly, the fact that the oscillations of the cycling genes cross the
PL-PSM and PM-PSM territories in a posterior to anterior direction implies that the
segmentation clock provides the PSM cells with bidimensional positional information. In
aggrement, cross-stripes of the molecular clock genes expression were observed in the
PSM. Grafting experiments performed in our laboratory further revealed that only the
PM-PSM cells contain the information for segmentation, that is possibly transmitted by
the median pit (MP), which is the morphological Hensen’s node at the stage of 6-somites.
To test this possibility, we performed heterochronic, heterotopic, interspecific quail-chick MP and PM-PSM grafts and checked for the capacity of the MP region to induce somite
formation in an ectopic competent region of a younger host embryo. The analysis of these
experiments revealed that in fact, the MP is able to induce the formation of ectopic
somites as well as the expression of the cycling genes in induced PSM tissue. Hence, the MP seems to be an important signalling centre detaining the information for
segmentation. These findings also propose that the MP is the functional organizer at the
stage of 6-somites in chick embryos.
Another important subject in the line of this thesis was to uncover the molecular
mechanisms underlying the onset of the segmentation clock during chick embryonic
development. We showed that the segmentation clock was not activated at the very beginning of embryo formation, since both spontaneous and artificially generated double axis which derive from the same embryonic blastoderm, presented different phases of the expression of the cycling genes in their PSMs. Conversely, the phase of the cycle was always the same when the caudal part of the embryos was joined together. These results led us to verify whether Hensen’s node was responsible for triggering the initiation of the segmentation clock. So, a series of heterotopic interspecific quail-chick Hensen’s node grafts were performed and our results showed that the node is able to induce ectopic PSM
tissue and to reinitiate the segmentation clock. The same observation was made when
chick node grafts were transplanted to the lateral blastoderm of the same embryo. Taken
together these findings revealed that the node emits a signal(s) able to induce the
oscillations of the cycling genes in cells that are not fated to become somites and that it
also has the capacity to restart the segmentation programme in these cells.
In the final part of this thesis we focused on the study of possible differences
between the formation of anterior and posterior somites, in the chick embryo. The fact that rostral somites do not give rise to segmented structures and are not disrupted in
several somitogenesis-related mutants has led to the generally accepted idea that they are different from caudal somites. In addition, it was reported in zebrafish and mouse that the first somites appear to form faster than more posterior ones. We analysed the expression of notch1, delta1, hairy1, hairy2, lunatic fringe and hey2 at the level of the first 10 somites, and we found that the somitic expression pattern profile is not the same along the anterior-posterior axis and that the differences are not observed at the same somite level. We have additionally designed a time-lapse experiment that allowed us to monitor somite formation in vivo. A detailed analysis of the monitored embryos indicates that the first 2 to 3 somites form faster, almost concomitantly, than the more posterior ones. Thus, we conclude from this work that there are relevant differences in anterior versus posterior somites in what concerns their molecular and temporal characteristics in the chick embryo
