Actualmente o transplante de tecido do próprio doente ou de um dador continua a ser a técnica mais utilizada para tratar defeitos ósseos provocados por doenças ou acidentes. No entanto, esta prática apresenta sérias limitações devido à escassez de dadores, ao risco de transmissão de doenças e/ou de rejeição imunológica e também devido ao problema da lesão dos tecidos envolventes que normalmente ocorre no local de onde é removido o tecido para transplante. O elevado número de pessoas em todo o Mundo que são afectadas por estes problemas, bem como os consequentes custos sócio-económicos, são razões acrescidas para a necessidade de desenvolver terapias alternativas para tratar a perda ou mau funcionamento de tecido ósseo.
A Engenharia de Tecidos é uma área científica em contínua expansão. Os desenvolvimentos conseguidos por esta área têm contribuído significativamente para diversos avanços no campo da Medicina Regenerativa. Esta ciência interdisciplinar combina os conhecimentos de diversas outras áreas, tão distintas como a Engenharia de Materiais e a Biologia, com o objectivo de desenvolver substitutos sintéticos para tecidos humanos. Para se atingir este objectivo utilizam-se, de uma forma genérica, combinações específicas de células e de um material de suporte tridimensional com propriedades adequadas, gerando um material híbrido cujas características podem ainda ser moduladas através do sistema de cultura usado.
A presente tese é centrada no desenvolvimento de estratégias de engenharia de tecido ósseo
baseadas na cultura in vitro de células previamente “semeadas” num suporte tridimensional
(“scaffold”). Esta estratégia permite que as células adiram ao suporte, proliferem e segreguem matriz extracelular específica do tecido ósseo, até se obter um substituto artificial funcional com características do tecido original, que pode finalmente ser transplantado para tratar o defeito em causa. Para que uma estratégia deste tipo seja bem sucedida, pelo menos três componentes fundamentais devem ser cuidadosamente estudados: o material de suporte (scaffold), as células a usar e o sistema de cultura in vitro. Daí que os principais objectivos desta tese estejam relacionados com estes três aspectos, nomeadamente:
• Desenvolvimento de scaffolds biodegradáveis a partir de polímeros à base de amido de milho que induzam a adesão e proliferação celular e que apresentem propriedades adequadas, tais como a porosidade e interconectividade entre poros, de forma a proporcionar um ambiente que favoreça o desenvolvimento in vitro de um material híbrido com características similares ao osso humano.
• Estudo da utilização de células da medula óssea como uma potencial fonte de células para engenharia do tecido ósseo, uma vez que estas células podem ser facilmente recolhidas do próprio paciente a tratar por métodos não-invasivos (bioppsia) e em quantidades suficientes. Além disso, tratando-se de uma fonte de células autólogas (obtidas do próprio paciente) permitem evitar os riscos de transmissão de doenças contagiosas e/ou de rejeição pelo sistema imunológico.
• Estudo da influência das condições de cultura in vitro geradas por um bioreactor de perfusão (em comparação com os métodos tradicionais de cultura em condições estáticas) no desenvolvimento dos materiais híbridos, compostos pelas células e scaffolds, assim como as interacções do ambiente proporcionado por este sistema de cultura com as diferentes estruturas/arquitecturas e porosidades dos scaffolds utilizados.
Estes objectivos convergem para o objectivo geral desta tese que consistiu no desenvolvimento de uma terapia de engenharia do tecido ósseo alternativa ás existentes e com potencial para vir a ser posteriormente utilizada na prática clínica. Este objectivo foi avaliado através do estudo da funcionalidade dos materiais híbridos obtidos em diferentes condições de cultura in vitro (e utilizando diferentes scaffolds), partindo do principio que o sistema de perfusão poderia eventualmente superar as limitações de difusão típicas dos sistema de cultura estática e simultaneamente proporcionar estímulos mecânicos ás células, semelhantes aos encontrados em condições fisiológicas.
O trabalhou desenvolvido permitiu propor várias metodologias de processamento que conduziram à obtenção de scaffolds com propriedades e estruturas porosas muito interessantes. De um modo geral, estes scaffolds permitem a adesão, proliferação e diferenciação das células de medula óssea, quando cultivadas em condições estáticas ou no bioreactor de perfusão. Foi demonstrado que a estrutura porosa dos scaffolds e specialmente a interconectividade entre poros, afecta a homogeneidade do tecido formado. A porosidade dos scaffolds influencia o desenvolvimento sequencial das células osteoblásticas e, em combinação com as condições de cultura usadas pode influenciar a funcionalidade dos “tecidos” formados in vitro.
Os resultados obtidos salientam a importância do sistema de cultura utilizado em estratégias
de engenharia de tecido ósseo como a que é proposta nesta tese. De facto, o bioreactor de perfusão contribui significativamente para melhorar a funcionalidade dos materiais híbridos/tecidos desenvolvidos in vitro, uma vez que combina factores biológicos e mecânicos que proporcionam um melhor desenvolvimento das células contidas no scaffolds, conduzindo á obtenção de um tecido mineralizado semelhante ao osso humano. Os resultados obtidos demonstram que a cultura de células de medula óssea em scaffolds biodegradáveis á base de amido de milho num bioreactor de perfusão, pode também constituir um modelo para o estudo de mecanismos biológicos associados ao processo de formação de tecido ósseo, o que por sua vez pode contribuir para a avaliação e melhoria de estrategias de engenharia de tecidos do osso.There is a very significant and well-known clinical need for the establishment of alternative therapies for the treatment of bone tissue loss or failure resulting from injury or disease, as the transplantation of tissues in these patients is severely limited by donor scarcity and is highly associated to the risk of immune rejection and disease transfer. The always evolving field of tissue engineering has brought a number of significant advances to regenerative medicine. This interdisciplinary science combines the knowledge and experience of many different fields, from materials science to biology, in order to develop tissue-like substitutes. This is generally achieved through a specific interplay between cells and scaffolds (and in some cases, growth factors), which can also be modulated by the culturing system used.
This thesis focuses on bone tissue engineering approaches based on culturing cells-scaffold
constructs in vitro, allowing the seeded cells to proliferate and secrete tissue specific extracellular matrix (ECM) until obtaining a functional tissue-like substitute that can be transplanted to the tissue defect to be treated. To achieve the success of such tissue engineering approach, there are at least three key issues that must be carefully studied: the scaffold material, the cells and the culturing environment. Therefore, the main objectives proposed for this thesis address these three aspects:
- Development of appropriate starch-based scaffolds capable of inducing the attachment and proliferation of the seeded cells, and exhibiting adequate properties, such as porosity and pore interconnectivity, in order to provide an appropriate environment for the in vitro development of bone-like tissue.
- Studying the use of bone marrow cells as a reliable cell source for bone tissue engineering application, as that can be readily available (in sufficient amounts) and obtained by simple procedures (biopsy) from the same patient, avoiding the risk risks of disease transmission and/or immune rejection.
- Studying the influence of in vitro culturing conditions, namely flow perfusion, on the development of cell-scaffolds constructs, as well as the interactions of the environment provided by this culturing method with different scaffolds architectures and porosities.
These objectives converge to the main goal of this thesis, which is the development of an improved bone tissue engineering therapy. This was assessed by the functionality of the tissue engineering constructs obtained under different in vitro culturing conditions (and from different scaffolds), in the light of using flow perfusion bioreactor having the potential to mitigate diffusion limitations typical of static culturing and simultaneously provide physiological-like stimulus to the seeded cells.
This work allowed for the development of a range of processing methodologies leading to scaffolds with different properties and porous structures, also depending on the synthetic component of the starch-based polymeric blend.
In general, these starch-based scaffolds allowed for the adhesion, proliferation and differentiation of marrow stromal cells towards the osteoblastic phenotype, under static and
flow perfusion conditions. It was demonstrated that scaffold architecture and especially pore interconnectivity affect the homogeneity of the formed tissue. The scaffolds porosity influences the sequential development of osteoblastic cells and in combination with the culture conditions may affect the functionality of in vitro formed tissues.
The work developed also emphasized the importance of the culturing system in bone tissue engineering approaches such as the one proposed in this thesis. Flow perfusion augments the functionality of scaffold/cell constructs grown in vitro as it combines both biological and mechanical factors that enhance cell differentiation and cell organization within the construct, towards the development of bone-like mineralized tissue. Additionally, this study also shows that flow perfusion bioreactor culture of marrow stromal cells combined with the use of appropriate starch based biodegradable scaffolds may also constitute a useful model to study bone formation and assess bone tissue engineering strategies in vitro.Fundação para a Ciência e a Tecnologia – POCTI
