Procedimiento para determinar la eficacia del tratamiento y el grado de progresión de la leucemia mieloide crónica mediante el uso de SPI-1/PU.1 que consiste en la determinación de mRNA o de proteína del gen SPI-1/PU.1, en muestras de células de sangre o médula ósea de pacientes de LMC y su comparación con muestras de sujetos sanos o del mismo paciente tras el tratamiento antileucémico. Niveles de mRNA o proteína de SPI-1/PU.1 altos o comparables a los de sujetos sanos son indicadores de respuesta al tratamiento. La presencia de SPI-1/PU.1 es indicador de respuesta al tratamiento y recuperación de hematopoyesis normal. Por el contrario, una expresión reducida es indicador de persistencia de la leucemia y mal pronóstico.Solicitud: 200402864 (22.11.2004)Nº Pub. de Solicitud: ES2315040A1 (16.03.2009)Nº de Patente: ES2315040B2 (16.10.2009

Albajar Molera, Marta

Delgado Villar, María Dolores

Gutiérrez Cianca, María del Pilar

Gómez Casares, María Teresa

León Serrano, Javier

Richard Espiga, Carlos

Spanish

UCrea

19© OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCASESPAÑA11© Número de publicación: 2 315 04021© Número de solicitud: 20040286451© Int. Cl.:C12Q 1/68 (2006.01)G01N 33/574 (2006.01)12© SOLICITUD DE PATENTE A122© Fecha de presentación: 22.11.200443© Fecha de publicación de la solicitud: 16.03.200943© Fecha de publicación del folleto de la solicitud:16.03.200971© Solicitante/s: Universidad de CantabriaPabellón de GobiernoAv. de los Castros, s/n39005 Santander, Cantabria, ES72© Inventor/es: León Serrano, Javier;Delgado Villar, María Dolores;Gutiérrez Cianca, Pilar;Albajar Molera, Marta;Richard Espiga, Carlos yGómez Casares, Maite74© Agente: No consta54© Título: Procedimiento para determinar la eficacia del tratamiento y el grado de progresión de la leucemiamieloide crónica mediante el uso de SPI-1/PU.1.57© Resumen:Procedimiento para determinar la eficacia del tratamientoy el grado de progresión de la leucemia mieloide crónicamediante el uso de SPI-1/PU.1 que consiste en la deter-minación de mRNA o de proteína del gen SPI-1/PU.1, enmuestras de células de sangre o médula ósea de pacien-tes de LMC y su comparación con muestras de sujetossanos o del mismo paciente tras el tratamiento antileucé-mico. Niveles de mRNA o proteína de SPI-1/PU.1 altos ocomparables a los de sujetos sanos son indicadores derespuesta al tratamiento. La presencia de SPI-1/PU.1 esindicador de respuesta al tratamiento y recuperación dehematopoyesis normal. Por el contrario, una expresión re-ducida es indicador de persistencia de la leucemia y malpronóstico.ES2315040A1Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid5101520253035404550556065ES 2 315 040 A1DESCRIPCIÓNProcedimiento para determinar la eficacia del tratamiento y el grado de progresión de la leucemia mieloide crónicamediante el uso de SPI-1/PU.1.Sector de la técnicaSector de la invención: Biomedicina. Marcadores de pronóstico de la enfermedad y como guía de los profesionalesmédicos para seleccionar o evaluar los tratamientos de leucemia mieloide crónica.AntecedentesEl factor de transcripción SPI-1/PU.1 es una proteína de la familia ETS, que juega un papel clave en la hematopo-yesis. SPI-1/PU.1 regula la expresión de genes importantes para la diferenciación mieloide y linfoide tales como losreceptores de los factores de crecimiento de macrófagos, de granulocitos, la integrina CD11b y mieloperoxidasa, asícomo su propia expresión. También regula la expresión de genes de inmunoglobulinas (Friedman, 2002).Diversos estudios indican un papel fundamental de Spi-1 en el compromiso de las células pluripotentes hacia dis-tintos linajes hematopoyéticos. Los datos con ratones deficientes en SPI-1/PU.1 indican que esta proteína se requierepara el desarrollo tanto de la serie mieloide (granulocitos y monocitos) como linfoide (Lloberas et al., 1999). En pro-genitores eritroides la expresión normal de Spi-1 es baja y su sobreexpresión desregulada da lugar a eritroleucemia.La leucemia mieloide crónica (LMC) es una de las leucemias más frecuentes. La LMC es una enfermedad bifásica.Primero cursa con una fase crónica, que suele durar 2-4 años. En esta fase la enfermedad es relativamente benigna,pero desemboca en todos los casos en una crisis blástica, que conduce a la muerte normalmente en menos de un año,a no ser que se someta al paciente a un transplante de médula ósea en su fase crónica. Esta fase es frecuentementeprecedida de una fase acelerada, con características hematológicas intermedias entre la crónica y la blástica. Desde elpunto de vista celular la fase crónica se caracteriza por un número elevado de granulocitos maduros, mientras que enla fase blástica se acumulan formas blásticas, normalmente de serie mieloide, y con menor frecuencia, linfoide. Juntocon la linfocítica crónica es la leucemia más frecuente en gente mayor de 50 años, aunque de mucho peor pronósticoEL marcador molecular de la LMC es la proteína Bcr-Abl. Es una proteína de fusión con actividad proteína-tirosinaquinasa desregulada, debido a una traslocación que yuxtapone los cromosomas 19 y 22 y da a lugar al cromosomaFiladelfia, marcador citogenética de la LMC (Deininger et al., 2000; Faderi et al., 1999; Goldman and Melo, 2003).El Bcr-Abl está ya presente en la fase crónica, y los mecanismos que gobiernan la transición de la fase crónica a lacrisis blástica son desconocidos. Hasta ahora no se ha identificado un cambio molecular común o mayoritario en lascrisis blásticas respecto a la fase crónica.Históricamente, la LMC se ha tratado con busulfán e hidroxiurea, desde los años 80, con interferón α, que sueleninducir remisión hematológica (Silver et al., 1999). Más recientemente se ha introducido el imatinib, un inhibidor dela quinasa Bcr-Abl. Los excelentes resultados obtenidos le están convirtiendo en el fármaco de primera línea en eltratamiento de la LMC (Kantarjian et al., 2002).Sin embargo, aunque estos fármacos, y especialmente el interferón y el imatinib pueden inducir remisiones hema-tológicas, citogenéticas y moleculares en la fase crónica, y el imatinib incluso en fase acelerada (Talpaz et al., 2002)y blástica (Druker et al., 2001; Sawyers et al., 2002), el único tratamiento curativo de la LMC hoy conocido es eltrasplante alogénico de médula ósea en su fase crónica (Goldman and Melo, 2003). Se ha demostrado también que laeficacia curativa del trasplante es menor cuanto más tiempo lleva el paciente en fase crónica, pero es difícil evaluar eltiempo que lleva un paciente en fase crónica cuando se le hace el diagnóstico por primera vez (Goldman and Druker,2001).Hasta el momento, el único marcador molecular informativo sobre la evolución de la enfermedad en ausencia dedatos hematológicos y citogenéticas es la determinación de la presencia del mRNA de Bcr-Abl. Esta determinación sehace por RT-PCR, usando cebadores que mapean en los genes BCR y ABL. Aunque la detección de mRNA de Bcr-Abl es útil en la detección de enfermedad mínima residual, hasta el momento no hay marcadores moleculares de larespuesta al tratamiento en LMC.Los inventores habían demostrado y publicado anteriormente que la expresión de SPI-1/PU.1 aumentaba al tratarcélulas de una línea celular derivada de LMC (K562) con con interferón-α, (Gutierrez et al., 1997). Posteriormente,los inventores han demostrado que la expresión de SPI-1/PU.1 se correlaciona con una recuperación hematológica depacientes de LMC tratados con interferón-a e imatinib (resultados no publicados). Medida por RT-PCR, la expresiónde SPI-1/PU.1 es baja al diagnóstico y aumenta durante al tratamiento con interferón o con imatinib, concomitante conla normalización hematológica. En la figura 1 se presenta una muestra representativa de la expresión de SPI-1/PU.1en varios pacientes de LMC a lo largo de su tratamiento con interferón. Se obtuvieron resultados similares en 13 de 16casos analizados. En los cuatro casos de la figura, el tratamiento indujo la recuperación de la hematopoyesis normal.En estos ensayos se usó el gen de la proteína ribosomal S14 como gen “housekeeping” como control de la cantidad deRNA y cDNA de las muestras. Este resultado es consistente con lo descrito previamente por los inventores sobre que lasobreexpresión de SPI-1/PU.1 en células humanas K562, provoca parada proliferativa, inducción de la diferenciaciónmonocítica y bloqueo de la diferenciación eritroide (Gutierrez et al., 1997).25101520253035404550556065ES 2 315 040 A1Cuando se comparan los niveles de SPI-1/PU.1 (medidos por RT-PCR cuantitativa) en médula ósea de sujetossanos, de pacientes de LMC al diagnóstico, y pacientes en fase crónica tratados con interferón y con imatinib seencontró que los niveles de mRNA de SPI-1/PU.1 eran eran mayores en los pacientes tratados. En la Figura 2 seresumen estas observaciones en 10 muestras de sujetos sanos, 31 de pacientes de LMC al diagnóstico, 32 tratados coninterferón-α y 17 tratados con imatinib (varios de ellos con tratamiento previo con interferón-α.ReferenciasDeininger, M. W., Goldman, J. M., andMelo, J. V. (2000). The molecular biology of chronic myeloid leukemia.Blood 96, 3343-3356.Druker, B. J., Sawyers, C. L.,Kantarjian, H., Resta, D. J., Reese, S. F., Ford, J. M., Capdeville, R., and Talpaz,M. (2001). Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloidleukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med 344, 1038-1042.Faders, S., Talpaz, M., Estrov, Z., and Kantarjian, H. M. (1999). Chronic myelogenous leukemia: biology andtherapy. Ann Intern Med 131, 207-219.Friedman, A. D. (2002). Transcriptional regulation of granulocyte and monocyte development. Oncogene 21,3377-3390.Goldman, J. M., and Druker, B. J. (2001). Chronic myeloid leukemia: current treatment options. Blood 98, 2039-2042.Goldman, J. M., and Melo, J. V. (2003). Chronic myeloid leukemia–advances in biology and new approaches totreatment. N Engl J Med 349, 1451-1464.Gutierrez, P., Delgado, M. D., Richard, C., Moreau-Gachelin, F., and Leon, J. (1997). Interferon induces up-regulation of Spi-1/PU.1 in human leukemia K562 cells. Biochem Biophys Res Commun 240, 862-868.Kantarjian, H., Sawyers, C.,Hochhaus, A.,Guilhot, F., Schiffer, C.,Gambacorti-Passerini, C., Niederwieser,D.,Resta, D.,Capdeville, R., Zoeliner, U., et al. (2002). Hematologic and cytogenetic responses to imatinib mesylatein chronic myelogenous leukemia. N Engl J Med 346, 645-652.Lloberas, J., Soler, C., and Celada, A. (1999). The key role of PU.1/SPI-1 in B cells, myeloid cells and macrop-hages. Immunol Today 20, 184-189.Sawyers, C. L., Hochhaus, A., Feldman, E., Goldman, J. M., Miller, C. B., Ottmann, O. G., Schiffer, C. A.,Talpaz, M., Guilhot, F., Deininger, M. W., et al. (2002). Imatinib induces hematologic and cytogenetic responses inpatients with chronic myelogenous leukemia in myeloid blast crisis: results of a phase II study. Blood 99, 3530-3539.Silver, R. T., Woolf, S. H., Hehlmann, R., Appelbaum, F. R., Anderson, J., Bennett, C., Goldman, J. M.,Guilhot, F., Kantarjian, H. M., Lichtin, A. E., et al. (1999). An evidence-based analysis of the effect of busulfan,hydroxyurea, interferon, and allogeneic bone marrow transplantation in treating the chronic phase of chronic myeloidleukemia: developed for the American Society of Hematology. Blood 94, 1517-1536.Talpaz, M., Silver, R. T., Druker, B. J.,Goldman, J. M.,Gambacorti-Passerini, C.,Guilhot, F., Schiffer, C. A.,Fischer, T., Deininger, M. W., Lennard, A. L., et al. (2002). Imatinib induces durable hematologic and cytogeneticresponses in patients with accelerated phase chronic myeloid leukemia: results of a phase 2 study. Blood 99, 1928-1937.ExplicaciónLos inventores han observado que la expresión del gen humano SPI-1/PU.1 es alta en células de médula ósea desujetos sanos pero es significativamente más baja en muestras de pacientes de LMC al diagnóstico en fase crónica.Sin embargo, en pacientes de LMC que están en remisión hematológica, la expresión de SPI-1/PU.1 se recupera hastaalcanzar valores normales. Esta regulación positiva de SPI-1/PU.1 se ha observado tanto en pacientes de LMC tratadoscon interferón-α y con imatinib (los dos tratamientos hoy en uso para esta leucemia). El procedimiento que se presentaconsiste en medir la expresión de SPI-1/PU.1 en muestras de médula ósea de pacientes y referirla a una muestra dereferencia que exprese dicho gen. Esta referencia puede ser médula ósea de sujetos sanos o de una línea celular queexprese dicho gen, como K562 tratadas con interferón. Una expresión alta o recuperada de SPI-1/PU.1 es indicador derestablecimiento de hematopoyesis normal y/o una baja proporción de células leucémicas en la muestra considerada,y por tanto, una indicación de éxito del tratamiento.35101520253035404550556065ES 2 315 040 A1Descripción de las figurasFigura 1. Expresión de SPI-1/PU.1 durante la evolución de LMC. Las muestras 1.1., 2.1, 3.1 y 4.1 corresponden aldiagnóstico. Las siguientes son muestras de los pacientes 1, 2, 3 y 4 tomadas con durante el tratamiento con interferón-α. En todos los casos los pacientes entraron en remisión hematológica. Se observa como la expresión de SPI-1/PU.1aumenta según se va consiguiendo (mediante el tratamiento) la normalización hematopoyética. A la derecha se indicaentre paréntesis el tamaño de los amplicones de SPI-1/PU.1 y de S14. A la izquierda los tamaños de marcadores detamaño de DNA.Figura 2. Expresión de SPI-1/PU.1 (analizada por RT-PCR cuantitativa y normalizada respecto a la de S14) enmuestras de sujetos sanos (control), y pacientes de LMC al diagnóstico y tratados in interferón-a e imatinib. En cadacaso se indica el número de muestras analizadas. Las barras de error indican el Error Estándar de la Media.Modo de realizaciónSe extraerá RNA de células mononucleares separadas de médula ósea o de sangre periférica. El RNA se copiaa cDNA usando transcriptasa inversa y cebadores al azar (“random hexamers”) o bien oligonucleótidos específicosde regiones exónicas del gen SPI-1/PU.1 humano. El cDNA es amplificado usando como cebadores (“primers”) dosoligonucleótidos que mapean en secuencias exónicas del gen SPI-1/PU.1 humano. El resultado del PCR se puedeevaluar analizando los productos de la reacción de PCR por electroforesis en gel de agarosa o bien por PCR cuantitativao a tiempo real.45101520253035404550556065ES 2 315 040 A1REIVINDICACIONES1. Procedimiento para determinar la eficacia del tratamiento y determinar el grado de progresión de la leucemiamieloide crónica mediante el uso de SPI-1/PU.1, caracterizado por las siguientes etapas: a) determinación de lapresencia de mRNA o proteína SPI-1/PU.1 en células de médula ósea o sangre periférica de pacientes de LMC.b) Comparación de los niveles de mRNA o proteína de SPI-1/PU.1 de las células del paciente con los de célulasque expresen SPI-1/PU.1 (muestra de referencia) o bien con muestra de mRNA del mismo paciente tras recibir eltratamiento a evaluar.2. Procedimiento para evaluar el pronóstico, determinar la eficacia del tratamiento y determinar el grado de progre-sión en la fase crónica de la LMC, según la reivindicación primera, caracterizado porque la determinación específicade la presencia de dicho marcador pronóstico SPI-1/PU.1 se realiza mediante un ensayo de RT-PCR usando oligo-nucleótidos cebadores (“primers”) específicos del cDNA del gen SPI-1/PU.1 humano, y usando RNA de células desangre periférica o de médula ósea de pacientes de LMC.5ES 2 315 040 A16OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCASESPAÑA11© ES 2 315 04021© Nº de solicitud: 20040286422© Fecha de presentación de la solicitud: 22.11.200432© Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA51© Int. Cl.: C12Q 1/68 (2006.01)G01N 33/574 (2006.01)DOCUMENTOS RELEVANTESCategoría Documentos citados ReivindicacionesafectadasCategoría de los documentos citadosX: de particular relevanciaY: de particular relevancia combinado con otro/s de lamisma categoríaA: refleja el estado de la técnicaO: referido a divulgación no escritaP: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaciónde la solicitudE: documento anterior, pero publicado después de la fechade presentación de la solicitudEl presente informe ha sido realizado5 para todas las reivindicaciones  para las reivindicaciones nº:Fecha de realización del informe Examinador Página20.02.2009 M. Hernández Cuéllar 1/1A GUTIERREZ P., et al., "Interferon induces up-regulation of Spi-1/ 1-2PU.1 in human leukemia K562 cells" Biochememical and BiophysicalResearch Communications (1997), 240, páginas 862-868.Citado en la solicitud.1-2A LLOBERAS J., et al., "The key role of PU.1/Spi-1 in B cells,myeloid cells and macrophages" Immunology Today (1999), 20(4),páginas 184-189. Citado en la solicitud.A DELGADO MD., et al., "Spi-1/PU.1 proto-oncogene induces opposite 1-2effects on monocytic and erythroid differentation of K562 cells"Biochememical and Biophysical Research Communications (1998),252, páginas 383-391.A US 20030119043 A1 (TANNER et al.) 26.06.2003 1-2A WO 2004031409 A2 (ONCOTHERAPY SCIENCE INC.) 15.04.2004 1-2A US 20040161760 A1 (MANO) 19.08.2004 1-2A WO 9221032 A1 (THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA) 1-226.11.1992

Procedimiento para determinar la eficacia del tratamiento y el grado de progresión de la leucemia mieloide crónica mediante el uso de SPI-1/PU.1.

https://repositorio.unican.es/xmlui/bitstream/handle/10902/1047/ES2315040A1.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Procedimiento para determinar la eficacia del tratamiento y el grado de progresión de la leucemia mieloide crónica mediante el uso de SPI-1/PU.1.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

UCrea