Se describe un procedimiento para obtener cantidades ilimitadas de plaquetas humanas a partir de las líneas celulares K562 y KU812, derivadas de leucemias mieloides. El procedimiento se basa en el tratamiento con estaurosporina a concentraciones 50 a 100 nM durante 3 a 6 días. Las células pueden crecerse en suspensión y las plaquetas pueden ser separadas de las células por métodos estándar. Las plaquetas son reconocibles morfológicamente y comparten características bioquímicas y ultraestructurales con las plaquetas aisladas de sangre. Se puede obtener así una preparación de plaquetas humanas a partir de precursores celulares genéticamente idénticos y libre de otros productos biológicos de origen humano. Pueden ser usadas para fines analíticos como servir de estándar en ensayos plaquetarios biológicos o bioquímicos.Solicitud: 009900666 (05.04.1999)Nº Pub. de Solicitud: ES2155379A1 (01.05.2001)Nº de Patente: ES2155379B1 (01.12.2001

Lerga Flamarique, Ana

León Serrano, Javier

Richard Espiga, Carlos

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k19 OFICINA ESPA~NOLA DEPATENTES Y MARCASESPA~NAk11 Numero de publicacion: 2 155 379k21 Numero de solicitud: 009900666k51 Int. Cl.7: C12N 5/08k12 SOLICITUD DE PATENTE A1k22 Fecha de presentacion: 05.04.1999 k71 Solicitante/s: Universidad de CantabriaAvda. de los Castros s/n39005 Santander, Cantabria, ESk43 Fecha de publicacion de la solicitud: 01.05.2001 k72 Inventor/es: Leon Serrano, Javier;Lerga Flamarique, Ana yRichard Espiga, Carlosk43 Fecha de publicacion del folleto de la solicitud:01.05.2001k74 Agente: No constak54 Ttulo: Procedimiento para producir plaquetas humanas a partir de celulas en cultivo.k57 Resumen:Procedimiento para producir plaquetas humanas apartir de celulas en cultivo.Se describe un procedimiento para obtener cantida-des ilimitadas de plaquetas humanas a partir de laslneas celulares K562 y KU812, derivadas de leuce-mias mieloides. El procedimiento se basa en el tra-tamiento con estaurosporina a concentraciones 50 a100 nM durante 3 a 6 das. Las celulas pueden cre-cerse en suspension y las plaquetas pueden ser sepa-radas de las celulas por metodos estandar. Las pla-quetas son reconocibles morfologicamente y compar-ten caractersticas bioqumicas y ultraestructuralescon las plaquetas aisladas de sangre. Se puede obte-ner as una preparacion de plaquetas humanas a par-tir de precursores celulares geneticamente identicosy libre de otros productos biologicos de origen hu-mano. Pueden ser usadas para nes analticos comoservir de estandar en ensayos plaquetarios biologicoso bioqumicos.Venta de fascculos: Ocina Espa~nola de Patentes y Marcas. C/Panama, 1 { 28036 MadridES2155379A11 ES 2 155 379 A1 2DESCRIPCIONProcedimiento para producir plaquetas huma-nas a partir de celulas en cultivo.El invento se reere a un procedimiento paraproducir un preparado de plaquetas humanasa partir de celulas en cultivo, sin los riesgosbiologicos que conlleva su puricacion libre apartir de sangre humana. Las plaquetas proce-den de lneas celulares inducidas a diferenciacionmegacarioctica, y por tanto son geneticamenteidenticas. Tales plaquetas son generadas porcelulas de la lnea K562 o KU812 tratadas durante3-6 das con estaurosporina a concentraciones de50-100 nM.AntecedentesLas lneas derivadas de leucemia mieloide hu-mana se han usado como modelos de diferen-ciacion celular a los distintos tipo celulares deestirpe mieloide. Las celulas de estas lneas cre-ciendo en cultivo pueden diferenciarse in vitro enrespuesta a diversos productos, tanto de sntesiscomo naturales. La protena quinasa C es unafamilia de enzimas que tiene un importante papelen el control de la diferenciacion de celulas mieloi-des. As, diferentes isoenzimas de protena kinasaC se han visto implicadas en la diferenciacion aestirpe monoctica o eritroctica de celulas deriva-das de leucemia mieloide (Aihara et al., 1992; Ho-cevar et al., 1992; Nishikawa and Shirakawa 1992;Tonetti et al., 1994). Las celulas K562 derivande un paciente con leucemia mieloide cronica encrisis blastica (Lozzio and Lozzio, 1975) y se hadescrito su capacidad para diferenciarse a lneaeritroide con varios farmacos, como arabinosidode citosina (Rowley et al., 1981). En respuesta aesteres de forbol (activadores de protena quinasaC) como el 12-O-tetradecanoyl phorbol-13 ace-tate las celulas K562 se diferencian a un fenotipocon mezcla de marcadores tpicos de lnea mega-carioctica y monoctica, aunque la morfologa ce-lular predominante es la monoctica-macrofagica(Leary et al., 1987; Alitalo 1990). Sin embargo,hasta el procedimiento descrito en la presente Pa-tente no se conoca otro procedimiento capaz dediferenciar las celulas K562 de forma mayoritariaa lnea megacarioctica.ReferenciasAihara, H., Asaoka, Y., Yoshida, K., and Nishi-zuka, Y. Sustained activation of protein kinase Cis essential to HL-60 cell dierentiation to ma-crophage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:11062-11067,1991.Alitalo, R. Induced dierentiation of K562 leuke-mia cells: a model for studies of gene expressionin early megakaryoblasts. Leuk. Res. 14: 501-514, 1990.Hocevar B. A., Morrow D. M., Tykocinski M. L.,and Fields A. P. Protein kinase C isotypes in hu-man erythroleukemia cell proliferation and die-rentiation. J. Cell Sci. 101: 671-679, 1992.Leary, J. F., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Giuliano,R., LaBella, S., Farley, B., and Rowley, P. T.Mutipotent human hematopoietic cell line K562:lineage-specic constitutive and inducible anti-gens. Leuk. Res. 11: 807-815, 1987.Lozzio, C.B. and Lozzio, B.B. Human chronicmyelogenous leukernia cell line with positive Phi-5101520253035404550556065ladelphia chromosome. Blood 45: 321-324, 1975Nishikawa, M., and Shirakawa, S. The expressionand possible roles of protein kinase C in haemo-poietic cells. Leuk. Lymph. 8: 201-211, 1992.Rowley, P. T., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Farley,B. A., and LaBella, S. Inducers of erythroid di-erentiation in K562 human leukemia cells. Exp.Hematol. 9: 32-37, 1981.Tonetti D. A., Henning-Chubb, C., Yamanishi, D,and Huberman, E. Protein kinase C- is requiredfor macrophage, dierentiation of human HL-60leukemia cells. J. Biol. Chem. 269: 23230-23235,1994.Walker, D.H. (1998). Small-molecule inhibitorsof cyclin-dependet kinases: molecular tools andpotential therapeutics. Curr. Top. Microbiol.Inmunol. 227, 149-165, 1998.La lnea K562 y KU812 pueden obtenersede la coleccion American Type Culture Collec-tion (ATCC). Las celulas se crecen en medioRPMI suplementado con 8 % de suero bovino fe-tal. Tambien se le puede suplementar con an-tibioticos antibacterianos y antifungicos. A unaconcentracion celular de 200.000 a 500.000 celulaspor ml se a~nade estaurosporina a concentracionescomprendidas entre 50 y 100 nM, a partir de unasolucion stock en dimetilsulfoxido. Las condicio-nes tpicas son 50 nM de estaurosporina durante5 das partiendo de celulas a una concentracionde 300.000 celulas por ml de medio de cultivo.La estaurosporina es un inhibidor de serina-treonina protena quinasas (Walker, 1996). Laadicion de estaurosporina provoca la detenciondel crecimiento celular y, a partir de 24 horas detratamiento, diferenciacion megacarioctica en lascelulas. Al cabo de 4 das con 100 nM estauros-porina esta diferenciacion ya es maxima, llegandoal 90 % de las celulas presentes en el medio. Estadiferenciacion se puede identicar por:1. La morfologa celular, que demuestra la pre-sencia de celulas grandes con nucleo fuerte-mente polilobulado, detectable por tincionde Giemsa.2. Dotacion poliploide de DNA, detectable pordeterminacion de DNA por citometra deflujo de celulas te~nidas con yoduro de pro-pidio3. Membranas de demarcacion, detectablespor microscopa electronica.4. La expresion de marcadores megacariocti-cos como CD61 y CD41, detectable por ci-tometra de flujo de celulas incubadas conanticuerpos especcos.Aunque las celulas K562 tambien tienen ca-pacidad de diferenciacion monoctica o eritroidecon diversos agentes qumicos o farmacologicos, laausencia de diferenciacion monoctica en celulastratadas con estaurosporina se evidencia en lareaccion negativa o debilmente positiva de lasalfa-naftil esterasas (a diferencia de celulas K562con diferenciacion monoctica) y disminucion dela expresion de epsilon-globina y de la fraccionde celulas positiva a la reaccion de la bencidina(como las celulas K562 con diferenciacion eri-troide).23 ES 2 155 379 A1 4A partir de 3 das de incubacion con estauros-porina aparecen muchas celulas con aspecto demegacariocitos que desprenden fragmentos celu-lares en un proceso morfologicamente identico ala produccion de plaquetas por megacariocitos enmedula osea. Tambien empiezan a aparecer enel medio de cultivo partculas celulares identica-bles como plaquetas. Esta identicacion se haceen base a:1. Morfologa y tama~no tras la tincion de May-Gru¨nwald-Giemsa2. Reaccion positiva con el acido peryodico(PAS)Las plaquetas pueden separarse de las celulaspor metodos estandar: centrifugacion diferencialo centrifugacion sobre capa de coll. Las plaque-5101520253035404550556065tas as obtenidas presentan caractersticas mor-fologicas muy semejantes a las presentes enplasma humano.Este procedimiento permite la obtencion deplaquetas procedentes de un unico individuo, portanto de un origen genetico identico. Tambienpermite obtener plaquetas humanas a partir decultivos celulares, sin los riesgos biologicos queconlleva su puricacion a partir de sangre hu-mana.La preparacion de plaquetas derivadas de es-tas lneas celulares se puede usar por ejemplopara hacer suspensiones de plaquetas que sirvande estandar en ensayos analticos de fusion pla-netaria. Tambien se puede usar como fuente deprotenas plaquetarias si, por razones de seguri-dad biologica, no se quiere partir de sangre hu-mana.35 ES 2 155 379 A1 6REIVINDICACIONES1. Procedimiento para producir plaquetas hu-manas a partir de celulas en cultivo de las lneascelulares K562 o KU812, por tratamiento con in-hibidores de protena quinasas.2. Procedimiento para producir plaquetas hu-manas a partir de celulas en cultivo, segun la rei-vindicacion primera, caracterizado porque lascelulas K562 o KU812 se tratan con estaurospo-rina.3. Procedimiento para producir plaquetashumanas a partir de celulas en cultivo, segunla reivindicacion primera, caracterizado porquelas celulas al momento de a~nadir la estaurospo-rina estan a una concentracion de celulas K562 oKU812 es de 200.000 a 500.000 celulas por ml demedio.51015202530354045505560654. Procedimiento para producir plaquetas hu-manas a partir de celulas en cultivo, segun lareivindicacion primera, caracterizado porque laconcentracion de estaurosporina es de 50 nM a100 nM y el tratamiento antes de puricar lasplaquetas es de 2 a 7 das.5. Procedimiento para producir plaquetas hu-manas a partir de celulas en cultivo, segun la rei-vindicacion primera, caracterizado porque lascelulas se han de crecer en medio RPMI suple-mentado con 8 a 10 % de suero fetal bovino.6. Procedimiento para producir plaquetashumanas a partir de celulas en cultivo, segunla reivindicacion primera, caracterizado porqueel preparado de plaquetas obtenido no contieneotros componentes de origen humano que las pro-pias plaquetas y las sustancias producidas por lasmismas plaquetas.4OFICINA ESPA~NOLADE PATENTES Y MARCASESPA~NAk11 ES 2 155 379k21 N. solicitud: 009900666k22 Fecha de presentacion de la solicitud: 24.03.1999k32 Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICAk51 Int. Cl.7: C12N 5/08DOCUMENTOS RELEVANTESCategora Documentos citados ReivindicacionesafectadasA YEN A. et al. "12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate and 1,2staurosporine induce increased retinoblastoma tumor suppressorgene expression with megakaryocytic dierentiation of leukemiacells". 1993. Cancer Res., Vol. 53 (13), paginas 3085-91.A MURGO A. et al. "K562 leukemia cells express P2T (adenosine 1,2diphosphate) purinergic receptors". 1992. J. Pharmacol. Exp.Ther., Vol. 261 (2), paginas 580-5.A ES 2136103 T3 (KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.) 29.12.1993, 1,2pagina 3, lneas 50-53; pagina 13, lneas 35-45.A ADACHI M. et al. "Induction of smg p21/rap1A p21/krev-1 p21 gen 1,2expression during phorbol ester-induced dierentiation of ahuman megakaryocytic leukemia cell line". 1992. Oncogene.Vol. 7 (2), paginas 323-9.Categora de los documentos citadosX:Y:A:de particular relevanciade particular relevancia combinado con otro/s de lamisma categorarefleja el estado de la tecnicaO:P:E:referido a divulgacion no escritapublicado entre la fecha de prioridad y la de presentacionde la solicituddocumento anterior, pero publicado despues de la fechade presentacion de la solicitudEl presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n:Fecha de realizacion del informe Examinador Pagina05.04.2001 A. Collados Martn Posadillo 1/1

Procedimiento para producir plaquetas humanas a partir de células en cultivo.

https://repositorio.unican.es/xmlui/bitstream/handle/10902/1073/ES2155379A1.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Procedimiento para producir plaquetas humanas a partir de células en cultivo.

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