Remodelage des heparanes sulfate : caractérisation fonctionnelle et structurale de l'endosulfatase humaine HSulf-2

Abstract

Heparan Sulfate (HS) are complex polysaccharides involved in many biological processes. The structure of HS is regulated at the cell surface by unique extracellular endosulfatases, the Sulfs. Sulfs dramatically change HS functional properties, thereby being implicated in many physiopathological processes including cancer. Sulfs features two domains: a catalytic domain (CAT) that comprises the active site, and an hydrophilic basic domain (HD) responsible for HS binding. The aim of my PhD project is to characterize the structural and the functional properties of the human for HSulf-2, which remains poorly understood. In this context, we have first studied the enzyme/substrate recognition mechanisms. We identified two novel HS binding motifs on these enzymes implicated in their activity. In addition, using natural and synthetic oligosaccharides, we demonstrated that the HD is not essential for HS recognition, but is directs the processive and orientated desulfation of the polysaccharide. Moreover, we showed that a tetrasaccharide is the minimal oligosaccharide size required for HSulf-2 activity. Our results enabled us to propose a new model depicting the desulfation process of HS by the Sulfs. Second, we have shown that HSulf-2 is a proteoglycan, given that it harbors a unique PTM (Chondroitin Sulfate, CS chain) on its HD domain. This chain decreases enzyme activity and HS binding in vitro. In the tumoral microenvironment, using a murine orthotropic mammary tumor model, we showed that the CS chain is lost by proteolytic processing, leading to the activation of HSulf-2, and the promotion of tumor growth, vascularization and metastasis. Finally, we have undertaken the structural characterization of the Sulfs. For this, we decided to study separately the two domains found in these enzymes (CAT and HD). Crystallogenesis assays were undertaken for the CAT domain to solve its structure by X-ray crystallography, but were unsuccessful. Regarding the HD, we set up a protocol of production and purification of recombinant HD and we initiated NMR studies and other biophysics analyses in order to structurally characterize the domain and to identify the HS binding sites. Our preliminary results suggest that the HD is an unstructured domain, except for its N- and C-terminal parts. Overall, our data provide significant insights into this critical regulatory step of HS function.Les Héparanes Sulfates (HS) sont de polysaccharides complexes impliqués dans de nombreux processus biologiques. La structure des HS est contrôlée à la surface cellulaire par une famille particulière d‟endosulfatases extracellulaires, les Sulfs. Les Sulfs modifient dramatiquement les propriétés fonctionnelles des HS et sont impliqués dans de nombreux processus physiopathologiques, notamment le cancer. Ces enzymes se composent de deux domaines: un domaine catalytique (CAT) contenant le site actif et un domaine basique hydrophile (HD) responsable de la liaison aux HS. Le but de mon projet de thèse est de caractériser les propriétés structurales et fonctionnelles de la forme humaine HSulf-2, qui demeure à ce jour très mal connues. Dans ce cadre, nous avons tout d‟abord étudié les mécanismes de reconnaissance enzyme/substrat et caractérisé deux nouveaux motifs de reconnaissance des HS sur ces enzymes, responsable de leur activité. En utilisant des oligosaccharides naturels et synthétiques, nous avons aussi démontré que le domaine HD n'est pas essentiel pour la reconnaissance des HS, mais est permet une désulfatation processive et orientée du polysaccharide. De plus, nous avons identifié un tétrasaccharide comme étant la taille oligosaccharidique minimale requise pour l'activité de HSulf-2. Nos résultats nous ont permis de proposer un nouveau modèle décrivant le processus de désulfatation du HS par HSulf-2. D'autre part, nous avons montré que HSulf-2 est un protéoglycane, car il contient une modification post-traductionnelle unique (chaîne CS de Chondoitin Sulfate) sur son domaine HD. Cette chaîne diminue l'activité enzymatique et la liaison aux HS in vitro. Dans le microenvironnement tumoral, en utilisant un modèle de tumeur mammaire orthotopique murin, nous avons montré que la chaîne CS est libérée par protéolyse, conduisant à l'activation de HSulf-2, augmentant la capacité des tumeurs à se développer et à se transformer en métastase. Finalement, nous avons réalisé une étude structurale des Sulfs. Nous avons choisi d‟étudier séparément les deux domaines (CAT et HD). Des essais de cristallogenèse ont été menés pour le domaine CAT afin de résoudre sa structure par cristallographie aux rayons X, mais n‟ont pu aboutir. En ce qui concerne le HD, nous avons mis en place un protocole de production et de purification de HD d‟une manière recombinante et nous avons initiés une étude par RMN ainsi que d'autres techniques biophysiques afin de caractériser structuralement le domaine et d'identifier les sites de liaison aux HS. Nos résultats préliminaires suggèrent que la HD est un domaine non structuré, à l'exception de ses parties N- et C-terminales. L‟ensemble de ces travaux devrait nous permettre de mieux comprendre ces importants mécanismes de régulation des HS et de d‟envisager de nouvelles stratégies anticancéreuses ciblant les Sulfs