Activation de l’inflammasome NLRP3 au cours des bactériémies à E. coli ou S. aureus et durant l’infection à SARS-CoV-2

Abstract

At the early phase of bacterial or viral infections, innate immunity is able to detect some conserved microbial motifs (PAMP) recognized by receptors dedicated to these motifs (PRR), thus making it possible to initiate the pro-inflammatory reaction via different signaling pathways. Inflammasomes represent a family of PRR able to transform pro-IL-1β and pro-IL-18 into active pro-inflammatory cytokines as well as inducing a pro-inflammatory cell death called pyroptosis. NLRP3 is the most studied inflammasome. Many bacteria and viruses have been described as being able to either activate or inhibit the NLRP3 inflammasome, but the clinical implication of this activation or inhibition, under the control of a particular microorganism, remains undetermined at this time.The objective of my thesis was to study the involvement of the NLRP3 inflammasome during bacteremia in humans. The onset of the COVID-19 epidemic allowed us to expand this study to SARS-CoV-2 infection.The NLRP3-BACT protocol allowed us to implement a cellular test performed on whole blood to assess the level of Caspase-1 activation in monocytes and polymorphonuclear neutrophils (PMN) as well as the activation potential of the NLRP3 inflammasome in these cells in patients with S. aureus or E. coli bacteremia via flow cytometry (fluorescent inhibitor probe, FAM-FLICA).The objective of the CoVinnate protocol was to use the aforementioned cellular test to describe the activation of a part of the innate immune system in the various circulating myeloid cells of COVID-19 patients as well as the evaluation of this test as a prognostic tool.For NLRP3-BACT 22 patients have been included since the start of the study, 16 have undergone cytometric analysis. In this first series of patients included, we demonstrated that monocytes have a greater potential for Caspase-1 activation by Nigericin+LPS than healthy donors. In addition, basal activation of this caspase in monocytes is greater in intensive care patients and in those infected with E. coli compared to the ID ward and S. aureus respectively. Finally, the multiplication of the MFI of the FAM-FLICA signal induced by Nigericin + LPS is more important for medical patients compared to intensive care patients.For CoVinnate, 66 COVID-19 patients and 24 healthy donors were included during the study period. In CD66b+ CD16dim cells, we observed a significant decrease of the FAM-FLICA probe signal in the most severe patients compared to the controls. Within granulocytes, the activation of Caspase-1 induced by Nigericin was decreased in CD66b+ CD16dim cells according to the severity of the patients. We recorded an increase in Nigericin-induced activation of NLRP3 in non-classical monocytes isolated from the most severe patients, this effect was inversely correlated with the total number of non-classical monocytes. In the most severe patients there was an increase in the number of CD66b+CD16dimCD15+CD10- cells corresponding to immature neutrophils.We used the decreased number in non-classical monocytes and the failure of NLRP3 activation upon nigericin activation in CD66b + CD16dim granulocytes to build a prognostic score. We found a correlation between this score and the SpO2 / FiO2 ratio on the day of inclusion as well as 48 hours later. We also found a significant association of these two markers with the final outcome of the patients.My work has led to a better understanding of the involvement of the NLRP3 inflammasome in humans during bacteremia and during SARS-CoV-2 infection. We plan to use this work to characterize the response of patients to immunomodulatory treatments used in COVID-19, including corticosteroids.A la phase précoce d’une infection bactérienne ou virale l’immunité innée est capable de détecter certains motifs microbiens conservés (PAMP) reconnus par des récepteurs dédiés à ces motifs (PRR) permettant ainsi d’amorcer la réaction pro-inflammatoire via différentes voies de signalisation. Les inflammasomes représentent une catégorie de PRR capable de transformer la pro-IL-1β et la pro-IL-18 en cytokines pro-inflammatoires actives ainsi que d’induire une mort cellulaire pro-inflammatoire nommée pyroptose. NLRP3 est l’inflammasome le plus étudié. De nombreuses bactéries et de nombreux virus ont été décrits comme pouvant soit activer soit inhiber l’inflammasome NLRP3 mais l’implication clinique de cette activation ou inhibition, reste pour le moment indéterminée. L’objectif de ma thèse était d’étudier l’implication de l’inflammasome NLRP3 au cours de la bactériémie chez l’homme. L’apparition de l’épidémie de COVID-19 nous a permis d’élargir cette étude à l’infection par le SARS-CoV-2. Le protocole NLRP3-BACT nous a permis de mettre en œuvre un test cellulaire à partir du sang total afin d’évaluer le niveau d’activation de la Caspase-1 dans les monocytes et polynucléaires neutrophiles (PNN) ainsi que le potentiel d’activation de l’inflammasome NLRP3 dans ces cellules chez des patients présentant une bactériémie à S. aureus ou E. coli via une analyse par cytométrie en flux (signal FAM-FLICA).Le protocole CoVinnate avait pour objectif l’utilisation du test cellulaire précédemment mentionné afin de décrire l’activation d’une partie du système immunitaire inné dans les différentes cellules myéloïdes circulantes des patients COVID-19 ainsi que l’évaluation de ce test en tant qu’outil pronostique.Pour NLRP3-BACT 22 patients ont été inclus depuis le début de de l’étude, 16 ont bénéficié d’une analyse cytométrique. Dans cette première série de patients inclus nous avons mis en évidence que les monocytes présentent un potentiel d’activation de la Caspase-1 par Nigéricine+LPS plus important que les donneurs sains. Par ailleurs, l’activation basale de cette caspase dans les monocytes est plus importante chez les patients de réanimation et ceux infectés par E. coli. Enfin la multiplication de la MFI du signal FAM-FLICA induite par Nigéricine+LPS est plus important pour les patients de médecine comparativement aux patients de réanimation.Pour CoVinnate, 66 patients COVID-19 et 24 donneurs sains ont été inclus durant la période de l’étude. Dans les cellules CD66b+ CD16dim nous avons observé une diminution significative du signal de la sonde FAM-FLICA chez les patients les plus sévères comparativement aux témoins. Au sein des granulocytes, l’activation de la Caspase-1 induite par la Nigéricine était altérée dans les granulocytes CD66b+ CD16dim selon le degré de sévérité des patients. Nous avons enregistré une augmentation de l’activation de NLRP3 induite par la Nigéricine dans les monocytes non-classiques isolés chez les patients les plus graves, cet effet était inversement corrélé au nombre total de monocytes non-classiques. Chez les patients les plus sévères on notait une augmentation du nombre de cellules CD66b+CD16dimCD15+CD10- correspondant à des neutrophiles immatures. Nous avons utilisé la diminution des monocytes non-classiques et le défaut d’activation de NLRP3 par la Nigéricine des granulocytes CD66b+ CD16dim pour construire un score pronostique. Nous avons mis en évidence une corrélation entre ce score et le rapport SpO2 / FiO2 le jour de l’inclusion ainsi que 48 heures plus tard. Nous avons également constaté une association significative de ces deux marqueurs avec l’évolution finale des patients. Mon travail a permis de mieux comprendre l’implication de l’inflammasome NLRP3 chez l’homme au cours de la bactériémie et durant l’infection à SARS-CoV-2. Nous envisageons d’utiliser ces travaux pour caractériser la réponse des patients aux traitements immunomodulateurs utilisés dans la COVID-19 notamment les corticoïdes