Caractérisation structurale et fonctionnelle de l’opéron acc chez $Agrobacterium\ tumefaciens$ C58

Abstract

Agrobacterium tumefaciens is a soil bacterium responsible of the crown gall in plants when it possesses the Tumor inducing plasmid (pTi) which is also the virulence plasmid. The bacterium transfers a piece of DNA from the pTi into the plant genome. The transferred DNA codes for plant hormone synthesis, leading to the formation of tumors which are colonized by bacteria, on one hand, and on the other hand, for the synthesis of small molecules (opines) that are used as nutrients by A. tumefaciens. The opine agrocinopine A induces the production of quorum sensing signals responsible for the spread of the virulence plasmid from pathogenic to nonpathogenic bacterium. Agrobacterium radiobacter K84, a nonpathogenic bacterium, produces the agrocin 84, an antibiotic that kills A. tumefaciens.Import and catabolism of agrocinopine A are operated by acc operon, present on the pTi. The periplasmic binding protein AccA (PBP AccA) associated with the ABC transporter imports the opine into the periplasm where it is degraded by AccF and AccG. AccR regulates the expression of the acc operon and that of the transcription factor TraR, central in quorum sensing signaling. AccA also imports agrocin 84, which is activated by AccF. My PhD work focused on AccA and AccF specificity through structure-function studies and I initiated the study of the transcription factor AccR. The structural study of AccA in complex with agrocinopine A, agrocin 84 and derivatives from these molecules revealed that only the pyranose-2-phosphate motif, common in these two molecules, was recognized. Microcalorimetry and autofluorescence measurements confirmed this conclusion. The pyranose-2-phosphate motif would allow any compound possessing this motif at one end to be transported. The structure of the enzyme AccF showed that again only the pyranose-2-phosphate group is recognized. From the structure and molecular modelling of the substrate in the active site, an original mechanism of the phosphodiester bond cleavage is proposed. Microcalorimetry affinity measures showed that only the arabinose-2-phosphate and glucose-2-phosphate are capable of interacting with AccR. In cellulo experiments confirm that both compounds regulate the expression of quorum sensing.My work sheds light on import and use of agrocinopine in A. tumefaciens. Recognition specificity of the PBP AccA for a part of the imported molecule is observed in other PBPs and opens new ways for rational design of antibiotic compounds that, similarly to agrocin 84, would use the “Trojan horse” strategy.Agrobacterium tumefaciens est une bactérie du sol responsable de la galle du collet chez les plantes lorsqu'elle possède le plasmide Ti (Tumor inducing) dit de virulence (pTi). La bactérie transfère un morceau d’ADN du pTi dans le génome de la plante qui code d'une part la production d’hormones de plantes, à l’origine de la formation de tumeurs colonisées par les bactéries et d'autre part la production de petites molécules (opines) qui servent de nutriment à A. tumefaciens. L'opine, agrocinopine A induit la production de signaux quorum sensing à l’origine de la dissémination du plasmide de virulence vers des bactéries non pathogènes. Agrobacterium radiobacter K84, une bactérie non pathogène, produit de l’agrocine 84, un antibiotique qui tue A. tumefaciens.L’import et le catabolisme de l’agrocinopine A sont réalisés par l’opéron acc présent sur le pTi. La protéine périplasmique (PBP) AccA associée à un transporteur ABC importe l’opine dans le cytoplasme qui est ensuite dégradée par AccF et AccG. AccR régule l’expression de l’opéron acc et celle du facteur de transcription TraR, central dans la signalisation quorum sensing. AccA importe l’agrocine 84 qui est activée par AccF. Mon travail de doctorat a permis par des études structure-fonction de caractériser la spécificité d'AccA et d’AccF et d’initier l’étude du facteur de transcription AccR. L’étude structurale de la PBP en complexe avec l’agrocinopine A, l’agrocine 84 et des dérivés de ces molécules a révélé que seul le motif pyranose-2-phosphate commun aux 2 molécules était reconnu par AccA. Cela a été confirmé par microcalorimétrie et autofluorescence. Le motif pyranose-2-phosphate permettrait donc l’entrée de toute molécule qui le possède à une extrémité. La structure de l’enzyme AccF a montré que là encore seul le groupement pyranose-2-phosphate est reconnu. A partir de la structure obtenue et de modélisation du substrat dans le site actif, un mécanisme enzymatique original pour l’hydrolyse de la liaison phosphodiester est proposé. Les mesures d’affinité par microcalorimétrie montrent que seuls l’arabinose-2-phosphate et le glucose-2-phosphate sont capables de fixer AccR. Des expériences in cellulo ont confirmé qu'ils régulent bien l'expression du QS.Mes travaux apportent un éclairage nouveau sur l’import et l'utilisation de l’agrocinopine chez A. tumefaciens. La spécificité de reconnaissance de la PBP pour une partie de la molécule importée est observée chez d’autres PBP, et ouvre la voie à la conception de molécules antibiotiques qui, à l’image de l’agrocine 84, utilisent une stratégie de type « cheval de Troie »