L'analyse en molécule unique du récepteur de l’IL-2 révèle l'importance de son oligomérisation pour l'endocytose et la signalisation dans les lymphocytes

Abstract

Signaling by the interleukin-2 receptor (IL-2R) is regulated by its clathrin-independent endocytosis (CIE) and subsequent degradation, while playing a critical role in immunity. Interestingly, CIE lacks a coat protein that drives pit formation, raising the question of how the CIE vesicle is initiated. Protein clustering generates forces that can induce membrane conformational changes. Notably, IL-2R has been shown to accumulate at the base of membrane protrusions, where receptors might cluster and thereby initiate the pit.To study the relevance of IL-2R clustering in its endocytosis, we generated a CRISPR-edited T cell line expressing GFP-IL-2Rᵧ and analyzed its stoichiometry at the plasma membrane, by TIRF microscopy coupled to a single-molecule endocytic tracking method. We identified distinct IL-2Rᵧ cluster populations. IL-2Rᵧ seems to reach the cell surface as a preassembled cluster to which further molecules are added, reaching an optimal cluster size that is key for its internalization. Binding of IL-2 promotes the formation of endocytic clusters and receptor uptake, highlighting the importance of clustering for CIE internalization.Moreover, we found that cholesterol depletion increases the proportion of large, non-endocytic clusters as well as IL-2R signaling. Disruption of the actin meshwork also promotes the formation of large clusters, yet it decreases IL-2R signaling. Thus, both factors regulate IL-2R endocytosis and signaling in a distinct manner. Our results provide new insights into the mechanisms regulating receptor signaling and CIE.La signalisation par le récepteur de l'interleukine-2 (IL-2R), est régulée par son endocytose indépendante de la clathrine (EIC) et sa dégradation ultérieure, tout en jouant un rôle essentiel dans l'immunité. L'endocytose indépendante de la clathrine étant dépourvue de manteau protéique induisant la formation des puits, la question qui se pose est de savoir comment la vésicule d’IL-2R est-elle initiée. Le regroupement local des protéines peut induire des changements de conformation de la membrane et créer une invagination. Sachant que l'IL-2R s'accumule à la base des protubérances membranaires avant d’initier sa vésicule d’endocytose, nous avons analysé si le regroupement des récepteurs pourrait favoriser son internalisation. Pour étudier l’importance du regroupement de l'IL-2R, nous avons généré une lignée lymphocytaire humaine éditée (CRISPR) pour exprimer GFP-IL-2Rᵧ. Nous avons ensuite analysé la stoechiométrie du récepteur au niveau de la membrane plasmique, par microscopie TIRF couplée à une méthode de suivi de GFP-IL-2Rᵧ en molécule unique et identifié des populations distinctes d’oligomérisation. L'IL-2Rᵧ semble atteindre la surface cellulaire sous forme d'oligomères pré-assemblés auxquels d'autres molécules sont ajoutées, atteignant ainsi une taille d'oligomérisation optimale qui est essentielle à son internalisation. La liaison de l'IL-2 favorise la formation de ces oligomères, compétents pour l’endocytose, ce qui souligne l'importance du regroupement des récepteurs dans l'internalisation EIC.De plus, nous avons constaté que la déplétion du cholestérol augmentait la proportion de gros oligomères, non compétents pour l’endocytose mais induisant une forte signalisation. La perturbation du réseau d'actine favorise également la formation de gros oligomères, mais cette fois en diminuant la signalisation de l’IL-2R. Ainsi, les deux facteurs régulent l'endocytose et la signalisation de l'IL-2R de manière distincte. Nos résultats apportent de nouvelles connaissances sur les mécanismes régulant la signalisation des récepteurs et l’EIC