Synthèse de réactifs multifonctionnels et d'analogues de mycotoxine. Application à la détection de mycotoxines dans des solutions alimentaires.

Abstract

Mycotoxins are substances naturally produced by microscopic fungal species. Contamination of human food by such mycotoxins can lead to serious health problems. That's why, the World Health Organization recommended to control the mycotoxin concentration in food. Mycotoxins are detected by various conventional analytical methods. Even if these techniques are efficient, they are frequently expensive and time consuming. The purpose of our present work is to develop a novel immunofluorescence-based device to detect mycotoxins (Aflatoxin B1 and Patulin as proofs of concept). We aim to have a simple and accessible biosensor based as a competitive immunoassay for continuous flow detection involving a fluorescence resonance energy transfer (FRET). The procedure is based on SPIT-FRI method which can be used in different environments. Thus, my PhD work focused on the synthesis of heterotrifunctional crosslinkers « tripods », containing three different orthogonal groups (aminooxy, azido and thiol). This crosslinker is attached on a gold surface through the thiol functional group by self assembly monolayer adsorption (SAM). The aminooxy and azido functional groups are respectively used to graft a fluorophore as a donor energy D and a mycotoxin analog which structurally close to the target (respectively Aflatoxin B2 or Patulin ). The latter will be recognized by a specific antibodies equipped with the appropriate quencher (Acceptor) to enhance the FRET efficiency. Once the antibody bounds to the toxin analogue, the fluorescence in turned « OFF » through Fluorescence Resonance Emission Transfer (FRET). The detection of toxins on flow is based on a competetion immunoassay between the toxin and its analogue. The strong affinity of immobilized antibodies with toxins in food samples leads an interaction between them and will displace the antibody/quencher from the solid phase, and thus turn the fluorescence « ON ».Les mycotoxines sont des métabolites secondaires développées par différentes espèces de champignons. Elles sont présentes dans l’environnement et peuvent entrer dans la chaîne alimentaire, et provoquer des intoxications graves. De ce fait, des doses tolérables pour chaque mycotoxine ont été fixées par l’Organisation Mondiale de Santé. Une quantité infime de ces toxines peut contaminer l’ensemble de la chaîne alimentaire, il est donc nécessaire de mettre au point des méthodes de détection fines et sensibles des toxines résiduelles. Il existe des techniques de laboratoire longues et coûteuses pour détecter la présence de ces composés mais ces techniques ne sont pas à la portée des petits producteurs et difficilement exportable hors des laboratoires de recherche. Afin de mieux satisfaire les besoins du marché agroalimentaire, ce projet de thèse a eu pour but de développer un immunocapteur microfluidique pour la détection des mycotoxines (Aflatoxine B1 et Patuline) basé sur le phénomène de transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET). Ce dispositif « OFF-ON » repose sur la Méthode SPIT-FRI. L’outil se compose d’un réactif hétérotrifonctionnel « tripode » portant trois fonctions orthogonales entre elles (oxyamine, azoture et thiol). Cette molécule est localisée sur une surface d’or par sa fonction thiol par la méthode SAM. Les deux autres fonctions oxyamine et azoture ont servi respectivement pour le greffage d’un fluorophore jouant le rôle d’un donneur d’énergie et un analogue de mycotoxine. Ce dernier permet d’accrocher un anticorps spécifique anti-analyte marqué par un quencher (Accepteur d’énergie) adéquat au fluorophore. De ce fait, le phénomène de FRET entre ces deux partenaires s’opère. En présence de l’analyte introduit en flux, la forte affinité entre l’analyte par l’anticorps marqué permet une bioreconnaissance entre eux, ce qui a pour conséquence le déplacement de celui-ci. L’éloignement de l’anticorps et de son quencher permet le rétablissement du signal de fluorescence. D’où, une bioreconnaissance de l’analyte par l’anticorps marqué a lieu, ce qui a pour conséquence le déplacement de celui-ci. L’éloignement de l’anticorps et de son quencher permet le rétablissement du signal de fluorescence « ON »