Impacts des souches du genre Pseudomonas protéolytiques sur la stabilité des produits laitiers transformées : maitrise et prédiction de la qualité des laits UHT

Abstract

Dairy industries have sometimes problems of instability of UHT milk (Ultra High Temperature) during storage. This instability usually results in gelation or phase separation. Among the multifactorial causes (Zoological enzyme, Physico-chemical ...), proteolysis of casein micelles of UHT milk by heat-resistant proteases belonging to the genus Pseudomonas during storage, is often mentioned. This work has been conducted to understand the destabilization of UHT milk with raw milk previously contaminated by proteolytic Pseudomonas. Infrared spectroscopy Fourier transform has been explored in order to detect the cause and predict the stability of milk before their technological transformations. Initially, 32 strains of the genus Pseudomonas were selected according to their proteolytic potential and the presence of protease AprX (unique extracellular protease identified from Pseudomonas isolated from milk). All strains of the species P. fluorescens and P. tolaasii and some strains of the species P. chlororaphis, P. fragi and P. aeruginosa secreted this protease. Among the species P. aeruginosa and P. fragi, some strains secreted a protease with a molecular mass different from the one of the protease aprx. Regardless of the species studied and protease secreted, there was a proteolysis variability of the 32 strains. Some strains were proteolytic, while others were not. In a second step, the monitoring of the stability of UHT milk previously and independently inoculated by nine strains of P. fluorescens, secreting AprX but with different proteolytic potential, showed that this heterogeneity of proteolysis also happened in UHT milk. Some strains destabilized UHT milk before the end of 90 days of storage, while others did not. The addition of protease AprX in raw milk before UHT treatment also resulted in a destabilization of UHT milk before the end of 90 days of storage, confirming the role of this enzyme in the phenomenon of destabilization. The study with the strain P. fragi 9.12 that secreted a protease different from AprX, showed that it was able to destabilize UHT milk during storage. This result confirmed the fact that AprX was not the only extracellular protease bacteria of the genus Pseudomonas having an effect on the destabilization of UHT milk. For each experiment performed, the destabilization resulted in a formation of aggregation, in increases of non-protein and non-casein nitrogen contents (NPN and NCN) and in decreases of hydrations and zeta potentials of caseins micelles, indicating proteolysis of casein micelles. The results obtained by HPLC analysis coupled with mass spectrometry of NCN fractions of milk destabilized by 5 proteolytic strains of P. fluorescens and the protease AprX showed that this enzyme had a large action spectrum and was able to hydrolyze β, s1, s2 and κ casein. In a third step, FTIR spectroscopy was used to detect the presence of proteolytic bacteria of the genus Pseudomonas. This exploratory phase allowed us to determine the threshold for detection of milk contaminated with bacteria of the genus Pseudomonas and the discrimination threshold of milk containing proteolytic Pseudomonas from milk containing non-proteolytic Pseudomonas (5.102 CFU / mL). However, the analysis of milk containing a smaller quantity of proteolytic Pseudomonas than non proteolytic Pseudomonas, showed us that the character proteolytic dit not appears in the IR spectrum, while the risk of proteolysis was present. Further works have to be undertaken to use FTIR spectroscopy as a tool for predicting the stability of milk.L’industrie laitière rencontre parfois des problèmes d’instabilité du lait UHT (Ultra Haute Température) au cours de son stockage. Cette instabilité se traduit généralement par une gélification ou par une séparation de phases. Parmi les causes qui sont multifactorielles (zoologique, enzymatique, physico-chimique...) la protéolyse des micelles de caséines des laits UHT au cours de leur stockage par des protéases thermorésistantes appartenant au genre Pseudomonas est souvent évoquée. Ce travail a donc été effectué dans le but de mieux comprendre la déstabilisation du lait UHT dont le lait cru a été préalablement contaminé par des bactéries protéolytiques du genre Pseudomonas. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier a été explorée afin de détecter cette cause et de prédire la stabilité des laits avant leurs transformations technologiques. Dans un premier temps, 32 souches du genre Pseudomonas ont été sélectionnées en fonction de leur caractère protéolytique et de la présence de la protéase AprX (seule protéase extracellulaire identifiée à partir de Pseudomonas isolée du lait). Toutes les souches des espèces P. fluorescens et P. tolaasii ainsi que quelques souches des espèces P. chlororaphis, P. fragi et P. aeruginosa sécrétaient cette protéase. Parmi les espèces P. aeruginosa et P. fragi, certaines souches sécrétaient une protéase de masse moléculaire différente de celle de la protéase AprX. Indépendamment de l’espèce étudiée et de la protéase secrétée, il existait une variabilité de protéolyse au sein des 32 souches. Certaines souches étaient protéolytiques alors que d’autres ne l’étaient pas. Dans un second temps, le suivi de la stabilité de laits UHT préalablement et indépendamment inoculés par 9 souches de P. fluorescens, sécrétant AprX mais au caractère protéolytique différent, a montré que cette hétérogénéité de protéolyse existait aussi dans le lait UHT. Certaines souches déstabilisaient le lait UHT avant la fin des 90 jours de stockage alors que d’autres non. L’addition de la protéase AprX, dans le lait cru avant traitement UHT a également engendré une déstabilisation du lait UHT avant la fin des 90 jours de stockage confirmant le rôle de cette enzyme dans le phénomène de déstabilisation. L’étude réalisée avec la souche P. fragi 9.12 qui semblait sécréter une protéase différente d’AprX nous a montré qu’elle était capable de déstabiliser le lait UHT au cours du stockage. Ce résultat nous a conforté sur le fait qu’AprX ne serait pas la seule protéase extracellulaire des bactéries du genre Pseudomonas ayant un effet sur la déstabilisation du lait UHT. Pour chaque expérimentation effectuée, la déstabilisation se traduisait par une apparition d’agrégats, des augmentations des teneurs en azote non protéique et non caséinique (NPN et NCN) et des diminutions de l’hydratation micellaire et du potentiel zêta, nous indiquant une protéolyse des micelles de caséines. Les résultats obtenus par l’analyse HPLC couplée à la spectrométrie de masse des fractions NCN des laits déstabilisés par les 5 souches de P. fluorescens déstabilisantes et la protéase AprX, ont montré qu’AprX avait un large spectre d’action et était capable d’hydrolyser les caséines β, s1, s2 et κ. Dans un troisième temps, la spectroscopie IRTF a été utilisée dans le but de détecter la présence de bactéries du genre Pseudomonas protéolytiques. Cette phase exploratoire nous a permis de déterminer le seuil de détection d’un lait contaminé par une bactérie du genre Pseudomonas ainsi que le seuil de discrimination d’un lait contenant des Pseudomonas protéolytiques d’un lait contenant des Pseudomonas non protéolytiques (5.102 UFC/mL). Cependant, l’analyse d’un lait contenant minoritairement des Pseudomonas protéolytiques nous a montré que le caractère protéolytique ne ressortait pas sur le spectre IR alors que le risque de protéolyse était bien présent. Des travaux supplémentaires sont donc à réaliser afin que la spectroscopie IRTF soit utilisée comme un outil de prédiction de la stabilité des laits