Marqueurs diagnostiques et pronostiques de la stéatohépatite métabolique

Abstract

Obesity is a major public health problem in France since 50% of the population has overweight. Several hepatic complications of obesity exist including NASH, pathology characterized by the combination of histological lesions of hepatic steatosis and hepatitis, liver test abnormalities and the absence of known liver disease, particularly toxic (alcohol) or virus. In one third of patients, NASH leads to fibrosis and then cirrhosis. It also promotes the development of hepatocellular carcinoma.The pathophysiology of NASH is characterized by a deregulation of lipid metabolism that leads to the accumulation of lipids in the hepatocytes. This accumulation of lipids is toxic and one of the causes of insulin resistance and the development of diabetes mellitus. All stages of lipid metabolism are affected by an accumulation of triglycerides, an increase in hepatic lipogenesis and a decrease in ß-oxidation. The composition and the role of lipids as a promoter of NASH is being increasingly studied.The first part of the thesis concerns the detection of diagnostic markers of NASH. In this study, we established for the first time a lipid signature of nonalcoholic steatohepatitis by quantification of 32 lipids. The overall lipid signature allowed distinguishing controls from NAFL and NASH. We have also demonstrated a deregulation of the metabolic pathway involved in the synthesis of fatty acids in NASH. This deregulation has been observed in both humans and animal models in our study.The second part aimed to identify new hepatic prognostic markers of NASH. Microarray analysis of gene expression showed 1549 genes discriminating patients with NAFL or NASH, healthy obese or controls. Among them, 58 genes discriminated NASH from simple steatosis. These genes were involved in extracellular matrix remodeling and inflammation. The most discriminating gene was FABP4 (fatty acid binding protein 4). Among genes strongly associated with high expression of FABP4, matrix metalloproteinase-9 (MMP9) was overexpressed in 55% of NASH patients. We identified a total of 330 differentially regulated genes, of which 229 genes were overexpressed in NASH patients with high levels of MMP9 expression. Using the gene expression levels of the liver FABP4 and MMP9 genes as indicators of disease progression in an independent cohort of NAFLD patients, we identified patients with NAFL and NASH who may have a poor prognosis.Finally, in the third part, we looked at the diagnostic and prognostic value of steatosis of liver grafts, measured by FTIR (Infrared Fourier Transform Microspectroscopy). Indeed, steatosis, when it exceeds 60% and is macrovacuolar, is known to significantly impact the function and survival of liver grafts. In our study, among 58 graft samples, the average percentage of macrovacuolar steatosis and microvesicular steatosis assessed by the pathologist was 2% to 30%, respectively. The average concentration of liver triglycerides measured by gas chromatography-spectrometry was 214 [10-1045] nmol/mg liver tissue. The FTIR triglyceride content estimate was significantly correlated (r2=0.812) with the results of the average hepatic triglyceride concentration measured by gas chromatography-spectrometry. Thirty-four (58%) patients had complications defined by a Dindo-Clavien stage ≥2, including 2 non-primary graft function and 5 deaths. The most discriminating threshold between triglyceride level and TH failure was 59.29 and 54.02 nmol/mg hepatic tissue obtained by spectrometry and FTIR, respectively. Quantification of hepatic triglyceride content by GC/MS was significantly associated with patient survival at the end of follow-up (p <0.0001) and failure of transplantation (p <0.0001). Estimating hepatic triglyceride content using FTIR was significantly associated with one-year post-transplant survival (p <0.0001).L’obésité est un problème majeur de santé publique en France puisque 50% de la population est en surpoids ou obèse. Plusieurs complications hépatiques de l’obésité existent dont la NASH, pathologie caractérisée par l’association de lésions de stéatose et d’hépatite, d’anomalies des tests hépatiques. Chez un tiers des patients, la NASH conduit à l’apparition d’une fibrose puis d’une cirrhose. Elle favorise l’apparition du carcinome hépatocellulaire.La physiopathologie de la NASH est caractérisée par une dérégulation du métabolisme lipidique qui conduit à l’accumulation de lipides au niveau des hépatocytes. Celle-ci est toxique. La composition et le rôle des lipides comme promoteur de la NASH est de plus en plus étudié.Le premier volet de la thèse concerne la mise en évidence de marqueurs diagnostiques de la NASH. Dans cette étude, nous avons établi pour la première fois une signature lipidique de la NASH sur la base de la quantification de 32 lipides. Aucun des lipides identifiés ne permettait par lui-même de discriminer la stéatose de la NASH.En revanche, la signature lipidique globale permettait de distinguer les témoins patients des NAFL et des NASH. Nous avons également mis en évidence une dérégulation de la voie métabolique impliquée dans la synthèse des acides gras dans la NASH.Le deuxième volet avait pour objectif l’identification de nouveaux marqueurs pronostiques de la NASH. L'analyse par microarray d'expression de gènes a montré 1549 gènes discriminant les patients ayant une stéatopathie, NAFL ou NASH, des obèses sains ou des contrôle. Parmi eux, 58 gènes discriminaient la NASH de la stéatose simple. Ces gènes étaient impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire et l'inflammation. Le gène le plus discriminant était FABP4. Parmi les gènes fortement associés à une expression élevée de FABP4, la métalloprotéinase MMP9 était surexprimée chez 55% des patients NASH. Nous avons identifié un total de 330 gènes régulés de manière différentielle, dont 229 gènes étaient surexprimés chez des patients NASH présentant un niveau d'expression élevé de MMP9. En utilisant les niveaux d'expression génique des gènes FABP4 et MMP9 hépatiques comme indicateurs de la progression de la maladie dans une cohorte indépendante de patients atteints de NAFLD, nous avons identifié les patients atteints de NAFL et NASH susceptibles d'avoir un mauvais pronostic.Enfin, dans le troisième volet, nous nous sommes intéressés à la valeur diagnostique et pronostique de la stéatose des greffons hépatiques, mesurée par FTIR. En effet, la stéatose en particulier lorsqu’elle dépasse 60% et macrovacuolaire, est connue pour impacter significativement la fonction et la survie des greffons hépatiques. Dans notre étude, parmi 58 prélèvements de greffons, le pourcentage moyen de stéatose macrovacuolaire et de stéatose microvésiculaire, évalué par le pathologiste, était de 2% à 30%, respectivement. La concentration moyenne en triglycérides hépatiques mesurée par chromatographie couplée en phase gazeuse à la spectrométrie était de 214 nmol/mg de tissu hépatique. L'estimation de la teneur en triglycérides obtenue par FTIR était significativement corrélée (r2 = 0,812) avec les résultats de la concentration moyenne en triglycérides hépatiques mesurée par chromatographie couplée en phase gazeuse à la spectrométrie. Trente-quatre (58%) patients ont présenté des complications définies par un stade Dindo-Clavien ≥2, dont 2 non-fonction primaire du greffon et 5 décès. Le seuil le plus discriminant entre le niveau de triglycérides et l’échec de la TH était de 54,02 nmol/mg de tissu hépatique obtenu par FTIR. La quantification du contenu hépatique en triglycérides par GC/MS était significativement associée à la survie du patient à la fin du suivi (p<0,0001) et à un échec de la transplantation (p <0,0001). L'estimation du contenu hépatique en triglycérides à l'aide de FTIR était significativement associée à la survie après greffe d'un an (p<0,0001)