Étude des effets protecteurs de la protéine PAP et de ses mécanismes d'action dans des modèles de colite aiguë

Abstract

Inflammatory bowel disease (IBD) is a group of chronic, complex and relapsing inflammatory conditions of GIT that has been a global health problem, with an increasing incidence. It includes two main forms, Crohn's disease (CD) and ulcerative colitis (UC), which are characterized by alternating phases of clinical relapse and remission. One of the molecules that has been studied by our research group in the treatment of IBD is the Pancreatitis Associated Protein I (PAP). PAP has a variety of activities, which includes anti-apoptotic, anti-inflammatory, antibacterial effects and proliferative, maintaining host-bacterial homeostasis in the mammalian gut. Several new strategies using lactic acid bacteria (LAB) for the expression or ability to metabolize molecules capable of reducing inflammation in inflammatory bowel diseases have been studied in recent years. Here, we first sought to determine whether PAP delivered at intestinal membrane by recombinant Lactococcus lactis strain, LL-PAP, is able to modulate the microbiota community and reduce the chemically induced intestinal inflammation. After a DiNitro-BenzeneSulfonic-acid (DNBS) challenge, mice treated with LL-PAP showed a decrease in the colitis severity compared to those treated with the control L. lactis strain. This effect was characterized by: protection against weight loss; lower macroscopical and histological scores; and down-regulation of pro-inflammatory cytokines secreted by lymphocytes in Mesenteric Lymph Node (MLN). Moreover after 5 days of treatment LL-PAP was able to increase the diversity of the microbiota and relative abundance of Eubacterium plexicaudatum, a bacterium producing an anti-inflammatory molecule, the butyrate. This modification of the microbiota could participate to the anti-inflammatory properties of LL-PAP. Then, we compared LL-PAP and a recombinant strain of Lactobacillus casei, LC-PAP, producing PAP in the treatment of acute colitis induced by DNBS. Beyond the comparison between both strains we also compared two different protocols of administration: i) a daily administration; or ii) an administration every 3 days. The analysis of weight loss, macroscopic score and cytokines showed us that Lactococcus lactis should be administered every day to confer protection, while Lactobacillus casei should be administered every 3 days to show a tendency to protect mice. Our data showed the importance of the vector and the timing of the treatment. We also performed the evaluation of the protection induced by a L. lactis strain delivering a plasmid for PAP expression by epithelial cells, LL-PAP cDNA, compared with LL-PAP in a murine model of DNBS acute colitis. We hypothesized that the use of the two different strains could modifiy the PAP concentration at different places. Administration of LL-PAP increases PAP into the lumen whereas the use of LL-PAP cDNA enhances the level of PAP produced by epithelial cells. Our results showed that both groups of recombinant L. lactis showed the same protective effect compared with LL empty group. Nevertheless, PAP-cDNA was able to induce the production of anti-inflammatory cytokines and this result may suggest an activation of Treg cells differentiation. Taken altogether, we can infer that the location of PAP delivery may influence its anti-inflammatory properties but not regarding weight loss and macroscopic scores. These results confirmed the choice of the strategy used to deliver the molecule is as important as the choice of the molecule per se.Les Maladies Inflammatoires Chroniques Intestinales (MICI) sont un groupe de maladies inflammatoires chroniques, complexes et récidivantes du Tractus Gastro-Intestinal (TGI). Elles sont un problème de santé mondial ayant une incidence croissante. Elles comprennent deux formes principales, la Maladie de Crohn (MC) et la Rectocolite Hémorragique (RH), caractérisées par des phases alternées de rechute clinique et de rémission. L'une des molécules qui a été étudiée par notre groupe de recherche dans le traitement des MICI est la Pancreatitis-Associated Protein I (PAP). La PAP a différentes activités, qui comprennent des effets anti-apoptotiques, anti-inflammatoires, antibactériens et prolifératifs Elle participe au maintien de l'homéostasie intestinale chez les mammifères. Plusieurs nouvelles stratégies utilisant des bactéries lactiques (BL) pour l'expression de molécules capables de réduire l'inflammation intestinale ont été étudiées ces dernières années dans notre laboratoire. Ici, nous avons d'abord cherché à déterminer si la PAP délivrée au niveau de la membrane intestinale par une souche recombinante de L. lactis, LL-PAP, est capable de moduler la composition du microbiote et de réduire l'inflammation intestinale. Après une inflammation provoquée par l’injection de de Di-Nitro-Benzène-Sulfonique (DNBS), les souris traitées avec la LL-PAP montrent une diminution de la sévérité de la colite par rapport à celles traitées avec la souche témoin L. lactis. Cet effet est caractérisé par: une protection contre la perte de poids; scores macroscopique et histologique plus faibles; et la régulation à la baisse des cytokines pro-inflammatoires sécrétées par les lymphocytes dans le ganglion mésentérique lymphatique. Après 5 jours de traitement, la LL-PAP augmente la diversité du microbiote et l'abondance relative d'Eubacterium plexicaudatum, une bactérie productrice d’une molécule anti-inflammatoire, le butyrate. Cette modification du microbiote pourrait participer à l’effet anti-inflammatoire de LL-PAP. Ensuite, nous avons comparé LL-PAP avec une souche recombinante Lactobacillus casei, LC-PAP, exprimant la PAP dans le traitement de la colite aiguë induite par le DNBS. Au-delà de la comparaison entre les deux souches, nous avons également comparé deux protocoles d'administration différents : i) une administration journalière ; ou ii) une administration tous les 3 jours. L'analyse de la perte de poids, du score macroscopique et des cytokines nous a montré que Lactococcus lactis doit être administrée tous les jours pour conférer une protection, tandis que Lactobacillus casei doit être administrée tous les 3 jours pour montrer une tendance à protéger les souris. Nos données ont donc montré l'importance du vecteur et du timing du traitement. Nous avons également comparé la protection induite par une souche de L. lactis délivrant un plasmide codant pour l'expression de PAP dans les cellules épithéliales, LL-PAP cDNA, avec LL-PAP dans un modèle murin de colite aiguë au DNBS. Nous avons fait l’hypothèse que l’utilisation des deux différentes souches entraine l’augmentation de PAP à deux endroits différents. L’administration de LL-PAP va augmenter la PAP dans la lumière intestinale alors que celle de LL-PAP cDNA l’augmente dans les cellules épithéliales. Nos résultats ont montré que les deux groupes de L. lactis recombinants présentaient le même effet protecteur comparé au groupe LL vide. Néanmoins LL-PAP cDNA est capable d'induire la production de cytokines anti-inflammatoires et ce résultat suggére une activation de la différenciation des cellules Treg. Pris dans leur ensemble, nous pouvons déduire que l'emplacement de l'administration de PAP peut influencer ses propriétés anti-inflammatoires, mais pas les effets sur la perte de poids et les scores macroscopiques. Ces résultats confirment que le choix de la stratégie utilisée pour délivrer la molécule est aussi importante que le choix de la molécule proprement dite