Rôle de la rémorine et des nanodomaines membranaires dans la signalisation de la réponse aux phytovirus

Abstract

In the battle against viruses, plants have evolved various defence mechanisms to protect themselves against pathogens. Membrane-bound plant proteins such as Remorin (REM) may restrict viral infection. REMs belong to a plant-specific multigene family, classified in six phylogenetic groups that are localized in plasma membrane nanodomains and for some of them in plasmodesmata. Our team previously showed that in tomato and Nicotiana benthamiana, overexpression of Solanum tuberosum group 1 isoform 3 (StREM1.3) limits the cell-to-cell spread of the potexvirus Potato virus X (PVX) without affecting viral replication. During my thesis, our data allowed to built a working model in which the Arabidopsis thaliana CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 3 (AtCPK3) is able to interact with group 1 REM in vivo, phosphorylates the N-terminal domain of StREM1.3 and, finally, with the help of uncharacterized proteins lead to the restriction of PVX cell-to-cell movement in N.benthamiana. N.benthamiana is perfect for viral experimentation, but is allo-tetraploid, making it difficult for genetic studies. Because of CPKs have 34 isoforms with likely functional redundancy between them, we switched to another pathosystem using the genetic toolbox of Arabidopsis thaliana and a potexvirus species able to infect A. thaliana, the Plantago Asiatica Mosaic Virus (PlAMV). The objectives are 1/ to study the contribution of different REM clades in potexvirus intercellular movement; 2/ to understand which CPKs are involved in this process using REM and CPKs single and multiple mutants, as well as AtCPKs over-expressors; 3/ To study the contribution of Group 1 REM and CPK3 on systemic potexvirus movement. We previously showed that, like PVX, PlAMV local movement is restricted by StREM1.3 and AtCPK3 in N.benthamiana. We optimized the experimental conditions to track and compare GFP-tagged PlAMV in different Arabidopsis genetic backgrounds. By using this method, we were able to track both local virus cell-to-cell movement and systemic infection through the whole plant. Group 1 REM and CPK single and multiple knock out mutants, as well as CPK over-expressors wereused. Interestingly, we did not detect any difference in propagation compared with control on various CPKs KO, except in cpk3 mutant. Indeed, both in local and systemic, PlAMV propagation is enhanced on cpk3 mutant while CPK3 overexpressing lines display an opposite effect, demonstrating the great involvement of CPK3 in potexvirus propagation. Similarly, we demonstrate the redundancy of each isoform from group 1 REM on the restriction of the intercellular movement of PlAMV. Interestingly, REM promotes intercellular propagation of another viral genus, the potyvirus genus, suggesting that REM functions are not general for all genera. Globally, our results classify group 1 REM and CPK3 as antiviral defence protein both in local and systemic potexvirus infection, and suggest that REM function is viral genus dependent. This research will pave the way toward new host targets to fight phytovirus infection.Dans la lutte contre les virus, les plantes ont mis au point divers mécanismes de défenses pour se protéger contre les agents pathogènes. Les protéines végétales localisées à la membrane plasmique telles que les rémorines (REM) peuvent limiter l’infection virale. Les REM appartiennent à une famille de protéines multigéniques spécifiques à la plante, classées en six groupes phylogénétiques localisées dans les nanodomaines de la membrane plasmique et, dans certains cas, au niveau des plasmodesmes. Notre équipe avait précédemment montré que chez la tomate et Nicotiana benthamiana, la surexpression de l’isoforme 3 du groupe 1 de Solanum tuberosum (StREM1.3) limitait la propagation de cellule-à-cellule du Potato Virus X, un Potexvirus sans affecter la réplication virale. Au cours de ma thèse, nos données ont permis de construire un modèle de travail dans lequel une protéine kinase dépendante du calcium (AtCPK3) d’Arabidopsis thaliana est capable d’interagir in vivo avec StREM1.3, de phosphoryler le domaine N-terminal de StREM1.3 et, enfin, avec l'aide de protéines non caractérisées à ce jour, conduire à la restriction du mouvement de cellule à cellule de PVX chez N.benthamiana. N.benthamiana , parfaite pour l'expérimentation virale, est allo-tétraploïde, rendant de ce fait difficiles les études génétiques. Sachant qu’il existe 34 isoformes de CPKs, avec une redondance fonctionnelle probable entre elles, nous avons basculé sur un autre pathosystème : nous avons choisi Arabidopsis thaliana profitant de la « boîte à outils » génétiques que cette plante offre et nous avons choisi une autre espèce de virus, de la famille des potexvirus capable d'infecter A. thaliana : le Plantago Asiatica Mosaic Virus (PlAMV). Les objectifs sont 1 / d’étudier la contribution des différents clades de REM dans le mouvement intercellulaire des potexvirus 2 / comprendre quels CPK sont impliquées dans ce processus en utilisant les mutants simples et double de REM mais aussi de CPK, ainsi que les surexpresseurs AtCPK 3 / Etudier la contribution du groupe 1 de REM et de CPK3 dans le mouvement systémique du potexvirus. Nous avions précédemment montré que, comme le PVX, le mouvement local du PlAMV est limité par StREM1.3 et AtCPK3 dans N.benthamiana. Nous avons optimisé les conditions expérimentales pour suivre et comparer le PlAMV marqué GFP dans différents fonds génétiques d'Arabidopsis. En utilisant cette méthode, nous avons pu suivre à la fois le mouvement de cellule à cellule du virus localement, puis l’infection systémique à travers la plante entière. Les mutants knock-out simples et multiples du groupe 1 de REM, ainsi que les surexpresseurs CPK ont été utilisés. Fait intéressant, nous n'avons pas détecté de différence de propagation par rapport au contrôle sur divers mutants de CPK, sauf dans le mutant cpk3KO. En effet, tant au niveau local que systémique, la propagation du PlAMV est améliorée sur le mutant cpk3KO alors que les lignées surexprimant CPK3 présentent un effet opposé, démontrant la grande implication de CPK3 dans la propagation du potexvirus. De même, nous démontrons la redondance de chaque isoforme du groupe 1 de REM sur la restriction du mouvement intercellulaire du PlAMV. Il est intéressant de noter que REM favorise la propagation intercellulaire d’un autre genre viral, le genre Potyvirus, ce qui suggère que les fonctions de REM ne sont pas généralisables pour tous les genres. Globalement, nos résultats classifient les groupes 1 de REM et CPK3 en tant que protéines de défenses antivirales dans les infections aux potexvirus, que ce soit au niveau local ou systémique, et suggèrent que la fonction de REM est dépendante du genre viral. Cette recherche ouvrira la voie sur de nouvelles clés thérapeutiques, pour in fine, lutter contre les infections virales