analyse génomique et transcriptomique de bactéries productrices de carbapénèmases

Abstract

Multidrug resistant bacteria and in particular carbapenemase-producing Enterobacteriaceae remain a major health public challenge. Some successful clones are emerging globally, due to their high transmissibility and their ability to colonize and persist in patients over time. Genomic analyses revealed that the dissemination of KPC carbapenemase is closely related to the spread of Klebsiella pneumoniae of the sequence-type (ST) 258 and to few successful plasmids linked to IncFIIk family. However, the reasons of the association between K. pneumoniae ST258, IncFIIk plasmids and KPC that led to the rapid spread of this clone are currently unknown.Furthermore, there is no correlation between expression level of a carbapenemase-encoding gene, in vitro susceptibility to carbapenems and efficiency of a carbapenem-based treatment. Most of the time, KPC-producing K. pneumoniae exhibit a heteroresistant phenotype with carbapenems, but its clinical impact remains unknown. The mechanisms underlying the regulation of carbapenemases expression remain to be explored.The objectives of the thesis are to obtain deeper insights into genomic plasticity of carbapenemase–producing clones, and into the expression of their β-lactamases.The first part of this work was dedicated to the in vivo evolution of a single strain of KPC-producing K. pneumoniae ST258 that colonized a patient for almost 5 years. Genomic comparison of 17 isolates revealed a remarkable diversification with occurrence of several mutations with impact on bacterial virulence and susceptibility to antibiotics.Several studies extensively described the genetic structures of blaKPC-carrying plasmids, but information regarding gene expression at the whole plasmid level are lacking. Accordingly, we performed RNA-seq on Escherichia coli TOP10 transformed with an IncFIIk-IncFI blaKPC-2-carrying plasmid, with or without imipenem exposure. In both conditions, plasmid-encoded genes related to antimicrobial resistance and involved in plasmid replication were the most expressed. Imipenem exposure led to a more general response with overexpression of E. coli numerous chromosome-encoded genes involved in oxidative stress response. In addition, analysis of blaKPC-2 gene expression in several species using 5’RACE revealed the presence of several promoters whose strength depends on the bacterial genetic background. This could promote higher expression of blaKPC-2 gene and explain the association of some isoforms of Tn4401 in different species. The tools developed in the frame of this work were also applied to study a single Enterobacter kobei ST125 clone whose natural cephalosporinase (ACT-28) has increased hydrolytic activity towards imipenem. Finally, genomic analysis of the first ESBL-producing Shewanella sp. was performed. It revealed the presence of blaCTX-M-15 and blaSHV-2 genes carried on an IncA/C plasmid and a new chromosomally-encoded oxacillinase variant of OXA-48 with carbapenemase activity, called OXA-535. OXA-535 was found to be closely related to OXA-436, another carbapenemase which has recently spread in Enterobacteriaceae. Analysis of the genetic environment of both blaOXA-48-like genes confirmed the role of Shewanella spp. as progenitors of class D carbapenemases.Overall, this work contributes to a better comprehension of the diffusion of multi-drug resistant clones and of the mechanisms implicated in β-lactamase expression.Le combat contre les infections bactériennes reste un enjeu majeur de santé publique notamment avec la dissémination des Entérobactéries productrices de carbapénèmases, capables d’hydrolyser l’ensemble des β-lactamines. On assiste à l’émergence de certains clones épidémiques, se distinguant par leur distribution mondiale, leur forte transmissibilité et leur capacité à persister chez les patients. L’exemple le plus parlant est le cas du clone de Klebsiella pneumoniae appartenant au « sequence type » (ST) 258 et responsable de la diffusion mondiale de la carbapénèmase KPC (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase) portée majoritairement par des plasmides de la famille InFIIk. Les raisons du succès de ce clone et de l’association KPC/IncFIIk/ST258 ne sont pas encore totalement élucidées. Par ailleurs, il n’existe pas de corrélation entre le niveau d’expression d’une carbapénèmase, la sensibilité in vitro de la souche vis à vis des carbapénèmes et l’efficacité clinique d’un traitement par ces molécules. Les phénomènes d’héterorésistance aux carbapénèmes sont fréquents chez les souches produisant KPC, mais l’impact clinique est inconnu. Les mécanismes de régulation de l’expression des carbapénèmases ne sont pas élucidés.Les objectifs de cette thèse résident dans l’analyse des facteurs génétiques associés à la diffusion et la persistance de clones multi-résistants ainsi que l’analyse de l’expression des β-lactamases associées.La première partie de ce travail porte sur l’analyse de l’évolution in vivo d’une souche de K. pneumoniae ST258 produisant KPC ayant persisté chez un patient pendant près de 5 ans. L’analyse comparative des génomes provenant de 17 isolats a permis de mettre en évidence une diversification génétique importante ainsi que la sélection de mutations modifiant la virulence de la souche et sa sensibilité aux antibiotiques. Afin de caractériser les raisons du succès de certains plasmides portant KPC, une analyse transcriptomique d’une souche de Escherichia coli TOP10 transformée par un plasmide multi-réplicon IncFIIk-IncFIB exprimant KPC-2, a été réalisée en présence ou non d’imipénème. Les gènes les plus exprimés dans ces conditions sont les gènes de résistance aux antibiotiques et certains gènes essentiels à la réplication du plasmide. La présence d’imipénème affecte peu la transcription des gènes plasmidiques mais induit un stress oxydatif important dans l’ensemble de la souche.Par ailleurs, l’analyse de l’expression du gène blaKPC-2 dans différentes espèces par 5’-RACE a permis de révéler que ce gène de résistance est sous la dépendance de plusieurs promoteurs, dont la force diffère selon le fond génétique. Cette caractéristique pourrait expliquer le succès de certains isoformes du transposon Tn4401 permettant une meilleure expression du gène blaKPC-2, dans certaines espèces.Les outils développés dans cette thèse ont également été appliqués à l’analyse d’un clone d’Enterobacter kobei ST125 dont la céphalosporinase naturelle ACT-28 possède une activité d’hydrolyse accrue vis à vis de l’imipénème. Enfin, l’analyse du génome de la première souche Shewanella sp. produisant une BLSE de type CTX-M-15 a permis de révéler la présence d’un nouveau variant oxacillinase chromosomique avec activité carbapénèmase, appelé OXA-535. OXA-535 est proche d’OXA-436, un autre variant carbapénèmase porté par un plasmide ayant déjà disséminé chez les Entérobactéries. L’analyse de l’environnement génétique des gènes blaOXA-535 et blaOXA-436 confirme le rôle du genre Shewanella comme progéniteur des carbapénèmases de classe D.Ce travail contribue à une meilleure compréhension de la diffusion de certains clones multi-résistants et des mécanismes contrôlant l’expression des gènes de résistance aux β-lactamines