Role of c-di-AMP in the physiology of Streptococcus agalactiae

Abstract

Streptococcus agalactiae, également appelé streptocoque du groupe B (SGB) est une bactérie à Gram positif, capsulée, commensale des voies digestives et urogénitales. Cependant, le SGB est la principale cause d’infections invasives (septicémie, pneumonie et méningite) chez les nouveau-nés dans les pays occidentaux à haut revenu (UE, Amériques du nord). La virulence du SGB dépend de plusieurs facteurs impliqués dans l’adhésion et l’invasion tissulaire, ainsi que dans l’échappement au système immunitaire de l’hôte. Récemment, un nouveau mécanisme a été identifié au sein de l’Unité permettant au SGB de contrôler l’activation du système immunitaire inné par le di-AMP cyclique (di-AMPc) bactérien. Le di-AMPc est synthétisé spécifiquement par les bactéries et est reconnu par les cellules de l'hôte infectées pour induire une réponse immunitaire innée. Le SGB échappe à cette réponse immunitaire grâce à l'expression d'une enzyme ancrée à sa paroi, l’ecto-nucléotidase CdnP, qui est capable de dégrader le di-AMPc. La description du rôle du di-AMPc dans la relation hôte-pathogène nous a amené à étudier son rôle dans la physiologie du SGB. Au cours de ma thèse j'ai caractérisé le gène dacA codant pour la seule enzyme synthétisant le di-AMPc dans le SGB. L’inactivation conditionnelle de dacA a permis de démontrer que la synthèse de di-AMPc est essentielle à la croissance du SGB dans des conditions standards de culture, i.e. culture en milieu riche et en aérobie. En testant différentes conditions de croissance, j’ai observé que la synthèse de di-AMPc n’est plus essentielle lors d'une culture en milieu riche en anaérobie. Ainsi, la délétion du gène dacA a été obtenue dans ces conditions permissives. Les mutants dacA obtenus sont génétiquement très instables et accumulent des mutations secondaires compensatrices. Ces mutations ont été identifiées par séquençage et leurs effets confirmés par des tests fonctionnels de ré-expression de l'allèle original des gènes mutés. Globalement, les mutations permettant de compenser l’absence de synthèse de di-AMPc sont localisées dans des systèmes impliqués dans le maintien de la pression osmotique interne. Par une approche biochimique ciblée, les principales protéines fixant le di-AMPc ont été identifiées, parmi lesquelles des transporteurs de potassium, d’osmolytes, et un facteur de transcription original impliqué dans l’osmorégulation. A partir des approches génétique et biochimique, j’ai pu définir des conditions de culture dans lesquelles la synthèse de di-AMPc n’est plus nécessaire à la croissance i.e. culture dans un milieu synthétique en limitant l’apport de potassium et d’osmolytes. Ainsi, j’ai pu identifier la fonction essentielle du di-AMPc dans la régulation de la pression osmotique interne avec un rôle prépondérant des transporteurs d’osmolytes de type bétaïne. De façon intéressante, cette fonction est conservée dans les bactéries, mais les mécanismes mis en jeu diffèrent selon les espèces considérées, reflétant probablement une adaptation spécifique au métabolisme et aux conditions environnementales rencontrées par ces bactéries.Streptococcus agalactiae, also known as group B streptococcus (GBS) is a Gram-positive encapsulated bacterium, commensal of the intestinal and vaginal tracts. However, GBS is also the leading cause of neonatal invasive infections (septicaemiae, pneumonia and meningitis) in western countries (EU, North America). GBS virulence depend on several factors involved in adhesion and invasion of host cells, as well as evasion to host immunity. Recently, a novel mechanism was identified by the Unit allowing GBS to control the activation of innate immune system by bacterial cyclic di-AMP (c-di-AMP). c-di-AMP is specifically synthetized by bacteria and is recognized by host infected cells to induce an innate immune response. GBS escape to this immune response by expressing a cell wall anchored ectonucleotidase CdnP that degrade c-di-AMP. Given the role of c-di-AMP in host-pathogen interactions we characterized its role in bacterial physiology. During my PhD I have characterized dacA encoding for the unique enzyme that synthetized c-di-AMP in GBS. Conditional inactivation of dacA demonstrated that c-di-AMP is essential for GBS growth on rich medium in aerobiosis. By testing different growth conditions, I observed that c-di-AMP synthesis is dispensable on rich medium in anaerobiosis. This permissive condition was used to obtain dacA deletion mutants. The dacA mutants are genetically unstable and accumulate compensatory mutations. These mutations were identified by whole genome sequencing and their effects confirmed by re-expressing the WT allele of the mutated genes. Overall, the mutations allowing to compensate growth without c-di-AMP are localized in systems involved in the control of osmotic pressure. By a targeted biochemical approach, the main c-di-AMP binding proteins were identified, among them potassium and osmolyte transporters as well as an original transcription factor involved in osmoregulation. From the results of genetic and targeted biochemical approaches, I defined growth conditions where c-di-AMP synthesis is no more essential i.e. culture in synthetic medium by limiting potassium and osmolytes addition. Thus, I identified the essential function of c-di-AMP in the regulation of osmotic pressure with a major role of betain-type osmolytes transporters. Interestingly, this function is conserved in bacteria but different species-specific mechanisms are involved, this might reflect the metabolic adaptation of bacteria to their specific environments