Sélection, identification et caractérisation partielle d'antigènes du spermatozoïde du renard (Vulpes vulpes) en vue de leur utilisation dans un vaccin contraceptif

Abstract

The aim of this work was to identify antigenic proteins on fox (Vulpes vulpes) spermatozoa, in order to develop a contraceptive vaccine. First, we obtained antisera directed against sperm surface proteins dy rabbit and fox immunisation, and by fox vasectomy. Using this sera for Western blotting, 7 highly antigenic proteins were selected. They were named P3, P4, P5, P8, P11 and P13. Out of these 7 proteins, 6 were microsequenced dy using Edman chemistry. Then, we obtained the cDNA encoding the 6 antigens by using RACE PCR or RT-PCR. Two PCR products were used as probes for the screening of a fox testis cDNA library realised in our lab. This manuscript describe a strategy which allowed the selection and the identification of sperm antigens. Many studies are necessary in order to determine the full sequence and properties of these antigens. The determination of specific epitopes and of adapted delivery system could allows their use in a contraceptive vaccine.L'objectif de ce travail est d'identifier des antigènes du spermatozoïde de renard (Vulpes vulpes), en vue de leur utilisation dans un vaccin contraceptif. Pour cela, nous avons produit des sérums reconnaissant des protéïnes de surface du spermatozoïde par immunisation de lapins et de renards et par vasectomie de renards. Ces sérums nous ont permis de sélectionner par Western blot 7 protéines particulièrement antigéniques, nommées P3, P4, P5, P8, P11 et P13. Le séquençages NH2 terminal de 6 de ces protéines a été réalisé, puis des fragments de l'ADN codant ces antigènes ont été amplifiés par RACE ou RT-PCR. Deux de ces fragments ont été utilisés comme sonde pour le criblage d'une banque d'ADNc de testicule de renard, que nous avons réalisée, permettant le séquençage de l'ADN codant les antigènes P8 et P13. Afin de caractériser ces antigènes, des sérums polyclonaux monospécifiques ont été produits chez la souris, permettant pour la protéine P5 l'étude de la spécificité d'espèce, de la spécificité d'organe, son immunolocalisation, et l'évaluation de l'effet des anticorps sur la mobilité des spermatozoïdes et sur la liaison à la zone pellucide. D'autre part, la caractérisation biochimique (recherche de glycosylation) a été réalisée pour les 7 antigènes. Les protéines P4 et P8 présentent de fortes homologies avec des protéines mitochondriales, respectivement la NADH deshydrogénase et la cytochrome-C oxydase. P13 présente une forte homologie avec la protéine spermatique humaine fibrousheatin 2. Les antigènes P3 et P7 sont des glycoprotéines dont la séquence déterminée par RACE PCR ne présente pas d'homologie importante avec des protéines connues, mais suggère qu'elles pourraient avoir une localisation membranaire. Le sérum dirigé contre la glycoprotéine P5 a permis d'établir que cette protéine inconnue ne semble pas spécifique d'espèce ou d'organe, mais que les anticorps dirigés contre cette protéine réduisent la liaison des spermatozoïdes à la zone pellicule. Ce travail présente une strarégie ayant permis la sélection et l'identification d'antigènes psermatiques. Différentes études ont encore nécessaires pour déterminer la séquence et les propriétés de ces antigènes. la recherche d'épitopes spécifiques et d'une formulation vaccinale adaptée pourrait permettre leur utilisation dans un vaccin contraceptif