Analyse du mécanisme et du rôle de l'inhibition de l'autophagie par deux protéines complémentaires du cytomégalovirus humain

Abstract

Abstract: Autophagy is a constitutive and inducible mechanism of degradation of cytoplasmic components, in order to maintain the cellular homeostasis. Autophagy is often modulated by viruses, because it is also considered as an antiviral defense mechanism. It can have a beneficial role, when it is hijacked and regulated by viruses. We have previously observed in our laboratory that the human cytomegalovirus (HCMV) stimulates autophagosome formation, at the early stage of infection, independently of viral protein expression then, later on, it blocks autophagy. In this work, we showed that this virus has developed strategies involving the synthesis of several viral proteins, such as IRS1 and TRS1, to inhibit autophagy. Surprisingly, we also demonstrated a proviral role of autophagy at late stages of infection with HCMV. We showed, through biochemical and cellular imaging technologies, that expression of both TRS1 and IRS1 is able to block the formation of autophagosomes. We identified the mechanism of action of these proteins. It is independent of the protein kinase PKR but requires interaction with Beclin 1, a protein of the autophagic machinery. We mapped the interaction site of Beclin 1 with IRS1 and TRS1 in their N-terminal region and called it BBD for Beclin 1-binding domain. This domain (BBD)is conserved between the two proteins and essential to inhibit autophagy. We also identified the site of interaction of IRS1 in the coiled-coil domain (CCD) of Beclin 1. We characterized the role of IRS1 and TRS1 in the modulation of autophagy, in the context of viral infection, using different mutant viruses: viruses in which either the IRS1 or the TRS1 gene has been removed and a mutant virus lacking both IRS1 and TRS1 genes. Our results suggest that both IRS1 and TRS1 are involved in the regulation of this process. To better understand the role of the interaction of these proteins with Beclin 1, we studied the phenotype of a mutant virus that does not express IRS1 and which contains a deletion of the N-terminal region of TRS1. We showed that this mutant does not bind to Beclin 1 and is not able to block autophagy. Surprisingly, it has no defects in viral production, suggesting that inhibition of autophagy is not essential for viral replication. We developed other approaches, including the use of pharmacological modulators of autophagy or shRNA knockdown, which show that the inhibition of autophagy is able to reduce viral production and, on the contrary, that its stimulation increases it. These results suggest that autophagy may be beneficial to HCMV in certain conditions.Résumé : L’autophagie est un mécanisme constitutif et inductible de dégradation des composants cytoplasmiques afin de maintenir l’homéostasie cellulaire. Elle est souvent modulée par les virus car il s’agit également d’un mécanisme de défense antiviral. Elle peut avoir un rôle proviral quand elle est détournée et régulée par les virus. Nous avons précédemment observé au laboratoire que le cytomégalovirus humain (HCMV) stimule la formation des autophagosomes de manière précoce indépendamment de l’expression des protéines virales, puis qu’il entraine un blocage de l’autophagie aux temps tardifs. Dans ce travail, nous avons montré que ce virus a développé des stratégies impliquant la synthèse de deux protéines virales, IRS1 et TRS1, pour inhiber l’autophagie. De façon surprenante, nous avons également mis en évidence un rôle proviral de l’autophagie aux temps tardifs de l’infection par le HCMV. Nous avons pu montrer par des techniques de biochimie et d’imagerie cellulaire que l’expression aussi bien de TRS1 que d’IRS1 est capable de bloquer la formation des autophagosomes dans les cellules. Nous avons identifié le mécanisme d’action de ces protéines. Il est indépendant de la protéine kinase PKR mais nécessite une interaction avec Beclin 1, une protéine de la machinerie autophagique. Nous avons localisé le site d'interaction de Beclin 1 avec IRS1 et TRS1 (BBD pour Beclin 1 binding domain) au niveau de leur région N-terminale. Ce domaine, conservé entre les deux protéines, est nécessaire pour l’inhibition del’autophagie. Le site d’interaction d’IRS1 a été identifié dans le domaine en superhélice (coiled-coil domain) CCD de Beclin 1. Nous avons caractérisé le rôle de TRS1 et IRS1 dans la modulation de l’autophagie dans le contexte de l’infection virale, en utilisant différents virus mutants : des virus dans lesquels on a supprimé soit le gène IRS1, soit le gène TRS1 et un virus dans lequel il manque les deux gènes IRS1 et TRS1. Les résultats obtenus suggèrent qu’IRS1 et TRS1 sont effectivement toutes les deux impliquées dans ce processus. Afin de mieux comprendre le rôle de l’interaction de ces protéines avec Beclin 1, nous avons étudié le phénotype d’un virus mutant qui n’exprime pas IRS1 et qui contient une délétion de la région BBD de TRS1. Nous avons montré que ce virus mutant ne se lie pas à Beclin 1 et qu’il ne bloque pas l’autophagie. De manière surprenante, il n’a pas de défaut de production virale, suggérant que l’inhibition de l'autophagie ne serait pas essentielle pour la réplication virale. Nous avons développé d’autres approches, comme l’utilisation de modulateurs pharmacologiques de l’autophagie ou de lentivirus hébergeant des shRNA, qui montrent que l’inhibition de l’autophagie est capable de diminuer la production virale et au contraire que sa stimulation l’augmente. Ces derniers résultats suggèrent que l’autophagie pourrait être bénéfique au HCMV dans certaines conditions